CD40/CD40L系统在脑梗塞疾病发生发展中的作用及机制研究

摘要

第一章 CD40基因多态性与汉族人群脑梗塞遗传易感性的关联研究
　　研究背景:脑梗塞(cerebral infarction，CI)又名缺血性脑卒中，主要是由于脑动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)和血栓形成，使管腔狭窄甚至闭塞，导致急性局灶性脑供血不足而引起的疾病。CI发病率高、死亡率高，并呈逐年上升趋势，严重危害人类健康。大量证据表明AS是CI的主要病理基础。多种分子和信号途径参与了CI的病理生理过程。CD40/CD40L信号参与调控免疫、炎症、氧化应激、高凝等多种病理生理状态，在AS发生、发展以及斑块破裂诸多环节中发挥重要作用。国内外大量的研究已经证实，CI是遗传因素与环境因素共同作用所导致的多基因疾病，多种基因的遗传多态性与CI的发生发展密切相关。近年来研究发现，编码合成人类CD40的基因也存在单个核苷酸序列多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，这些功能性SNP可以通过改变CD40的表达和活性，引起下游生物学效应的相应变化，从而影响包括CI在内的一系列自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生发展。
　　目的:通过病例-对照研究，阐明CD40基因多态性与汉族人群CI遗传易感性关联关系，为CI形成的机制提供新的实验证据，并为寻找CI防治药物提供薪思路。
　　方法:收集CI患者及健康对照者血液标本并提取外周血DNA，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对所有病例和正常对照组人群CD40 rs1883832(C/T)多态性进行基因分型;ELISA试剂盒检测正常组和病例组三种基因型个体血浆sCD40L水平;实时荧光定量PCR测定CI患者外周血单个核细胞(PBMCs)中CD40mRNA表达;x2检验比较病例和对照人群CD40 rs1883832(C/T)基因型分布的异同;非条件Logistic回归分析确定CD40 rs1883832(C/T)多态性对CI易感性的影响;单因素方差分析(ANOVA)比较不同基因型个体血浆sCD40L水平和不同基因型个体PBMCs中CD40表达水平。
　　结果:1、785例健康对照人群中rs1883832多态性位点CC、CT和TT基因型分布频率分别为35.4％、48.4％和16.2％;473例CI患者中CD40 rs1883832(C/T)多态性位点CC、CT和TT基因型分布频率分别为28.1％、53.5％和18.4％，病例和对照人群中该位点基因型分布均符合Hardy-Wenberg平衡，CI病例组和对照组间CD40rs1883832多态性位点三种基因型分布具有显著差异，P值为0.028。通过对性别、年龄及CI病因分层分析发现:1）较正常对照组男性，病例组男性CC基因型频率显著降低(P=0.013);2)在50岁以上人群中，CI患者较同年龄层健康对照人群CD40 rs1883832 CC基因型分布频率显著降低(P=0.006);3)与对照组比较，腔隙梗死性CI患者CC基因型分布频率显著降低(P=0.028)。
　　2、CD40 rs1883832多态性位点基因型为TT和CT的男性CI患者血浆sCD40L水平较CC基因型个体显著升高(P＜0.05)。
　　3、CD40 rs1883832多态性位点TT基因型个体PBMCs中CD40mRNA表达水平显著高于该位点CC、CT基因型个体(P＜0.05)。
　　结论:1）CD40rs1883832(C/T)多态性位点与汉族人群CI易感性相关，携带该位点T等位基因可增加汉族人群CI的发病风险;
　　2）CD40 rs1883832多态性位点T等位为危险等位基因。
　　第二章 CD40介导姜黄素对血管紧张素Ⅱ、同型半胱氨酸诱导的内皮损伤的保护作用研究
　　研究背景:脑梗塞(cerebral infarction，CI)，是一类严重危害人类健康的脑血管疾病，主要由动脉粥样硬化引起，以脑组织发生缺血、缺氧、坏死而引起的神经功能障碍为主要临床表现。血管内皮细胞是血管组成的重要细胞之一，合成和释放多种血管活性因子，在脑血管病的自身调节中发挥重要作用，血管内皮损伤是多种心血管疾病的始动因素。内皮细胞上表达有CD40蛋白，CD40活化后可激活包括核转录因子NF-κB在内的下游信号通道，上调促炎和促血栓基因的表达，进而影响内皮及循环功能。姜黄素(curcumin)是从植物姜黄中提取的一种黄色酸性酚类物质，是姜黄发挥药理作用的主要活性成分。姜黄素可多途径抑制核转录因子NF-κB的激活，下调包括多种NF-κB下游基因的表达，发挥抗氧化、抗炎、抗增殖等多种药理学效应。
　　目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、同型半胱氨酸(Hcy)诱导的血管内皮损伤中CD40的表达变化，以及姜黄素对血管内皮损伤的保护作用是否通过抑制CD40信号通路所介导。
　　方法:AngⅡ造模实验分设正常对照组、AngⅡ损伤模型组(AngⅡ10-5M)、AngⅡ损伤与姜黄素低中高剂量(10-6M、3×10-6M、10-5M)共同作用组、阳性药物组（AngⅡ10-5M+替米沙坦10-5M）。Hcy造模实验分设正常对照组、Hcy损伤模型组（Hcy10-3M）、Hcy损伤与姜黄素低中高剂量（10-6M、3×10-6M、10-5M）共同作用组、阳性药物组（瑞舒伐他汀10-5M）。Hoechst33258染色检测细胞凋亡;Real-time PCR检测HUVEC-C细胞中CD40 mRNA表达水平;WesternBlot检测HUVEC-C细胞中CD40蛋白表达水平。
　　结果:1、AngⅡ可显著上调HUVEC-C内皮细胞中CD40 mRNA的表达，与正常组比较，差异具有显著性(P＜0.05);不同浓度姜黄素预处理能抑制AngⅡ所致CD40 mRNA的上调，且姜黄素高浓度组能显著抑制AngⅡ所致CD40 mRNA的上调(P＜0.05);
　　2、AngⅡ能明显上调CD40蛋白表达，与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05);高浓度姜黄素预处理能显著抑制AngⅡ所致CD40蛋白表达的上调，与AngⅡ组比较具有显著性差异(P＜0.05);
　　3、Hcy可显著上调HUVEC-C细胞中CD40 mRNA的表达，与正常组比较，差异具有显著性(P＜0.05)，不同浓度姜黄素预处理可抑制Hcy所致CD40 mRNA的上调，高浓度姜黄素可显著抑制Hcy所致CD40 mRNA的上调(P＜0.05);
　　4、Hcy能明显上调CD40蛋白表达，与对照组相比差异具有显著性(P＜0.05);高浓度姜黄素预处理能显著抑制Hcy所致CD40蛋白表达的上调(P＜0.05)。
　　结论:姜黄素可下调AngⅡ、Hcy诱导的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC-C) CD40 mRNA和蛋白表达的增加，对AngⅡ、Hcy诱导的内皮损伤起保护作用。
　　第三章姜黄素对PBMCs中CD40表达的影响及与CD40基因多态性的关系
　　研究背景: CD40/CD40L信号通路是T细胞活化的重要辅助刺激通路，不仅在调节T细胞免疫反应中起关键作用，而且也在B细胞的活化、增殖、分化、抗体的分泌中起重要作用。CD40/CD40L系统通过外周血单个核细胞(PBMCs)介导的炎症免疫反应可能参与了AS斑块的发生、发展、破裂和血栓的形成。CD40 rs1883832位点能够通过改变CD40/CD40L系统的水平而影响心、脑血管疾病的发生发展。原代PBMCs可以进行基因分型，是考察CD40 rs1883832基因多态性对损伤及药物反应性差异研究的最佳细胞模型。
　　目的:培养CD40 rs1883832 SNP位点不同基因型个体原代PBMCs，研究Hcy损伤以及姜黄素对CD40不同基因型个体PBMCs中CD40表达的影响，以探讨Hcy的损伤作用以及姜黄素的治疗作用与CD40基因多态性之间是否存在关联。
　　方法:收集健康志愿者外周血30 mL，提取外周血基因组DNA，并进行基因分型，同时分离提取外周血PBMCs，培养后分为溶媒组，Hcy造模组、Hcy损伤与1×10-5mol/L姜黄素共同作用组、瑞舒他汀（阳性药物）组进行预处理，Real-time PCR检测PBMCs中CD40mRNA表达水平;Western Blot检测PBMCs中CD40蛋白表达水平。
　　结果:1、10-3M Hcy处理PBMCs24h后，携带CD40 rs1883832T等位的PBMCs CD40 mRNA的表达水平增加3倍，携带T等位的PBMCs CD40 mRNA的表达水平是CC基因型的2倍;
　　2、10-3M Hcy显著上调CD40蛋白的表达，携带CD40 rs1883832T等位的PBMCs CD40蛋白上升程度显著高于未携带T等位个体;
　　3、姜黄素和瑞舒伐他汀可阻断Hcy诱导的CD40水平的升高，携带CD40 rs1883832 T等位的PBMCs对这种姜黄素和瑞舒伐他汀保护作用更为敏感。
　　结论:携带T等位的PBMCs在接受Hcy处理后表现出更为显著的损伤效果，携带CD40 rs1883832 T等位的PBMCs对姜黄素的保护作用更为敏感。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 CD40基因多态性与汉族人群脑梗塞遗传易感性的关联研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 试剂和仪器

2．2 样本、临床资料的收集和处理

2．3 外周血基因组DNA的提取

2．4 CD40 rs1883832基因分型

2．5 琼脂糖凝胶电泳

2．6 血浆sCD40L水平检测

2．7 人外周血单个核细胞(PBMCs)的提取

2．8 mRNA提取和实时定量PCR(real-time PCR)

2．9 统计分析

3 结果

3．1 CD40基因多态性与缺血性脑卒中遗传易感性的关联关系分析

3．2 CI患者与正常对照人群血浆sCD40L水平比较及与CD40 rs1883832(C／T)多态性的关系

3．3 CI患者与正常对照人群PBMCs CD40 mRNA表达水平比较及与CD40 rs1883832(C／T)多态性的关系

附图

4 讨论

5 结论

第二章 CD40介导姜黄素对血管紧张素Ⅱ、同型半胱氨酸诱导内皮损伤的保护作用研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 试剂和仪器

2．2 人脐静脉内皮细胞株培养

2．3 实验设计与分组方法

2．4 Hoechst33258染色检测细胞凋亡

2．5 荧光实时定量PCR(real time PCR)检测CD40 mRNA的表达

2．6 Western-Blot印迹杂交检测CD40蛋白表达水平

3 结果

3．1 MTT法检测姜黄素对HUVEC-C的细胞毒性

3．2 姜黄素与AngⅡ、Hcy诱导HUVEC凋亡的关系

3．3 姜黄素对内皮细胞中AngⅡ诱导CD40 mRNA表达上调的影响

3．4 姜黄素对内皮细胞中Hcy诱导CD40 mRNA表达上调的影响

3．5 姜黄素对内皮细胞中AngⅡ诱导CD40蛋白表达上调的影响

3．6 姜黄素对内皮细胞中Hcy诱导CD40蛋白表达上调的影响

附图

4 讨论

5 结论

第三章 姜黄素对PBMCs中CD40表达的影响及与CD40基因多态性的关系

1 前言

2 材料与方法

2．1 试剂和仪器

2．2 主要溶液的配制

2．3 样本的收集和处理

2．4 外周血基因组DNA的提取

2．5 CD40 rs1883832基因分型

2．6 原代PBMCs的提取及培养

2．7 原代PBMCs的分组和干预

2．8 Real time PCR检测CD40 mRNA的表达

2．9 Western-Blot印迹杂交检测CD40蛋白表达水平

3 结果

3．1 Hcy及姜黄素对CD40 rs1883832 SNP位点不同基因型PBMCs中CD40 mRNA表达的影响

3．2 Hcy及姜黄素对CD40 rs1883832 SNP位点不同基因型PBMCs中CD40蛋白表达的影响

附图

4 讨论

5 结论

全文总结

参考文献

综述一 The CD40／CD40L system：A new therapeutic target for disease

综述二 内皮祖细胞---抗动脉粥样硬化药物的新靶点

攻读学位期间主要的研究成果

致谢