高糖环境下成骨细胞分化与LIF及STAT3/SOCS3信号通路的关系机制研究

摘要

目的：检测2型糖尿病患者血清中hsCRP; IL-1β; IL-6和LIF的含量;分析其与高血糖的相关性;检测巨噬细胞RAW 264.7在高糖干扰下IL-1β; IL-6和LIF水平的变化;分析高血糖与炎症因子及LIF的相关性;检测高糖和LIF干扰成骨细胞后ALP; RUNX2; OCN和OPN含量的变化;研究STAT3/SOCS3信号通路在LIF介导的成骨细胞分化调节中的作用机制;为进一步研究 2 型糖尿病导致的成骨障碍提供分子生物学研究基础;为研究其药物治疗奠定基础。 方法：随机选择33例2型糖尿病患者及27例正常血糖患者;全部实验方法及实验过程均经医院伦理委员会通过和患者签署知情同意书;待检者均用抗凝管抽取 5ml 的静脉血液离心分离血清;我们利用酶联免疫吸附实验检测血清和细胞上清液中高敏感性 C 反应蛋白; IL-1β; IL-6和LIF;在450nm波长处测量其吸光度。将小鼠巨噬细胞RAW 264.7接入DMEM培养基;同时添加1% 非必需氨基酸;2mM 谷氨酸盐;10% 小牛血清(FBS);在37℃; 5%CO2下培养;使细胞浓度达到85%;随后用0.1%PBS洗涤;然后接入DMEM/EMEM培养基中;将0; 10; 30 or 60 mg/ml浓度的葡萄糖加入到培养基内;分别培养0; 0.5; 1; 2; 4小时;利用RT-PCR的方法检测IL-1β; IL-6 和LIF水平;利用酶联免疫吸附实验检测5; 15; 50和150mg/ml不同浓度的血糖及0; 20; 50; 100ng/ml LIF干扰下;成骨标志物ALP; RUNX2; OCN和OPN的变化情况;同时;我们利用RT-PCR的方法检测了在0; 20; 50; 100ng/ml LIF干扰下;成骨标志物ALP; RUNX2; OCN和OPN的mRNA变化情况;利用RT-PCR 方法检测 STAT3/SOCS3mRNA水平的变化;用50ng/ml LIF 干扰成骨细胞;利用 RT-PCR 方法检测在 0; 0.5; 1; 2; 4 小时STAT3/SOCS3mRNA水平的变化;用50 ng/ml LIF干扰成骨细胞;利用免疫印迹法检测在0; 0.5; 1; 2; 4小时STAT3/SOCS3蛋白水平的变化;利用不同浓度（0; 50nM）的JSI-124抑制成骨细胞STAT3的表达;用RT-PCR的方法分别检测成骨标志物ALP; RUNX2; OCN和OPNmRNA含量的变化。全部实验均独立完成三次;结果采用均数±标准误表示;显著性水平设定为0.05。 结果：2型糖尿病患者与正常人群在年龄、性别间差异无统计学意义;前者hsCRP 水平高于后者;经比较差异具有统计学意义;2型糖尿病患者血清炎症因子IL-1β; IL-6及LIF的水平高于正常人群;经比较差异具有统计学意义。30和60 mM的葡萄糖干扰巨噬细胞后;IL-1β及IL-6水平显著性升高;LIF 的水平同样随着葡萄糖的剂量升高而升高;经比较不同剂量组间差异具有统计学意义。 在5; 15; 50和150mg/ml 浓度的葡萄糖干扰下;成骨标志物ALP的水平显著性下调;呈剂量依赖性;在0; 20; 50; 100ng/ml LIF干扰下成骨标志物ALP的水平也显著性下调;不同剂量组间差异具有统计学意义。在5;15;50;150 mg/ml 浓度的葡萄糖干扰下;成骨标志物 RUNX2的水平显著性下调;在0; 20; 50; 100ng/ml LIF干扰下其规律也相同。同时我们检测了OPN和OCN;其规律与以上两者相同。然后我们单独用0; 20; 50; 100ng/ml LIF干扰下成骨细胞;ALP的mRNA的水平显著性下降;50; 100ng/ml LIF干扰下成骨细胞;RUNX2的mRNA同样也显著性下调;OCN和OPN的mRNA水平也同样下调;经比较LIF不同浓度组间差异均具有统计学意义。 用50ng/ml LIF干扰成骨细胞;利用RT-PCR方法检测在0; 0.5; 1; 2; 4小时STAT3mRNA水平无显著性的变化;经比较差异无统计学意义;而SOCS3mRNA在第2小时和4小时比其他时间组增大;经比较差异具有统计学意义;用0; 20; 50; 100ng/ml LIF干扰成骨细胞;利用RT-PCR方法检测在0; 20; 50; 100ng/ml LIF不同浓度组间STAT3mRNA水平无显著性的变化;经比较差异无统计学意义;而在20; 50; 100ng/ml LIF浓度组间SOCS3mRNA水平显著性增高;经比较差异具有统计学意义;利用免疫印迹法检测发现;用50ng/ml LIF干扰成骨细胞0; 0.5; 1; 2; 4小时;磷酸化STAT3/STAT3随着干扰时间的延长;其比值逐渐减小;经比较差异具有统计学意义;而SOCS3在第1小时显著性的增高;然后又逐渐的减小;经比较差异(1;2;4小时间）具有统计学意义;利用免疫印迹法检测发现;用0; 20; 50; 100ng/ml LIF干扰成骨细胞;磷酸化STAT3/STAT3在50;100ng/ml LIF干扰下其比值显著性升高;经比较（50; 100ng/ml与0; 20ng/ml组间）差异具有统计学意义;SOCS3在第20; 50; 100ng/ml LIF组间显著性的增高;经比较差异具有统计学意义。 不同浓度的 JSI-124 对于成骨细胞 STAT3 蛋白表达无影响;而SOCS3和磷酸化STAT3随着JSI-124的浓度的增加;表达逐渐下降;随着JSI-124浓度的升高;50ng/ml LIF干扰下成骨细胞其ALP; RUNX2; OCN和OPN mRNA含量逐渐升高。 结论： 1、2型糖尿病患者的LIF及炎症因子水平显著性升高。 2、高血糖促进巨噬细胞中IL-1β、IL-6和LIF 的产生。 3、高血糖促进炎症因子和LIF升高。 4、随着葡萄糖浓度的增加;成骨细胞成骨标志物 ALP; RUNX2; OCN和OPN的蛋白表达水平显著性下调;即葡萄糖对成骨细胞成骨具有抑制作用。 5、随着LIF浓度的增加成骨标志物ALP; RUNX2; OCN和OPN的蛋白表达水平显著性下调;即LIF对成骨细胞成骨具有抑制作用。 6、随着LIF浓度的增加成骨标志物ALP; RUNX2; OCN 和OPN的mRNA水平显著性下调;即LIF对成骨细胞成骨具有抑制作用。 7、LIF干扰成骨细胞;STAT3mRNA水平与培养时间无相关性;而SOCS3mRNA随培养时间的延长;其浓度增高。 8、不同浓度LIF干扰成骨细胞;STAT3mRNA水平无显著性的变化;而SOCS3mRNA水平显著性增高 9、LIF干扰成骨细胞;磷酸化STAT3/STAT3随着干扰时间的延长;其比值逐渐减小;SOCS3蛋白随着时间的延长先增大后减小 10、不同浓度LIF干扰成骨细胞;磷酸化STAT3/STAT3和SOCS3随着LIF浓度的升高而显著性的增高;抑制STAT3表达;可以抑制LIF降低成骨细胞骨化的作用;因此STAT3/SOCS3信号通路参与LIF介导的成骨细胞分化相关。

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