CD36介导的肾脏AA淀粉样变的机制研究

摘要

目的：
　　肾脏AA淀粉样变性（amyloidosis）是由多种慢性疾病状态所致的，突出特点是淀粉样物质在细胞内外沉积，通过各种途径诱导肾脏组织结构与功能异常。患者主要表现为肾病综合征，随病情进展晚期表现为明显肾衰竭症状，最终导致死亡。通过更好地控制炎症能明显改善其预后，但目前这个疾病的发病机制是不清楚的，更缺乏有效的治疗。脂肪酸转运酶（CD36）属于B族清道夫受体，是连接机体脂代谢和炎症的重要膜蛋白，被认为是治疗代谢性疾病的重要靶点。近年来有研究发现CD36参与了血清淀粉样蛋白A（SAA）的摄取及SAA诱导的炎性因子的分泌过程。本研究旨在探讨CD36是否参与了肾脏AA淀粉样变所致的肾脏损害及其作用机制。
　　方法：
　　第一部分：选取8周龄野生型（wild type,WT）小鼠，随机分为两组，0.5ml10%酪蛋白(Casein)隔日皮下注射为实验组（Casein组），对照组（Control组）给予等量生理盐水隔日皮下注射。按上述处理15周后先常规收集小鼠24h尿液，再采集眶静脉血离心取血清，最后分离肾脏组织。SAA浓度检测采用了酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒。小鼠肾脏淀粉样变模型的确认采用了刚果红染色；实验小鼠肾脏组织CD36的表达同时采用了免疫印迹（Western blot）和免疫组化两种方法检测。
　　第二部分：选取8周龄野生型（WT）小鼠和CD36-/-小鼠随机分为三组，0.5ml10%酪蛋白(Casein)隔日皮下注射为实验组WT Casein（+）和CD36-/-Casein（+）,对照组WT Casein（-）给予等量生理盐水隔日皮下注射。15周常规后收集小鼠尿液、血清液及肾脏组织。检测小鼠的血尿生化指标。刚果红及高锰酸钾处理后刚果红染色观察小鼠肾脏淀粉样变及类型；透射电镜（transmission electron microscope,TEM）、苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eeosinstaining,H&E）和MASSON染色观察肾脏病理改变，Western blot、Q-PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）检测肾脏损害的炎症及纤维化基因的mRNA和蛋白表达。
　　第三部分：动物实验：选用第二部分的WT Casein(+)和CD36-/-Casein(+)两个组的动物模型作为体内模型；电镜观察小鼠肾脏组织自噬体数量，Western blot、Q-PCR检测LC3的表达。免疫荧光检测肾脏组织的LC3和AA表达及两者的共定位关系。采用Western blot法和免疫组化法检测AMPK，P-AMPK的表达。CHIP实验进一步证明了CD36与LC3的启动子调节相关。细胞实验：选取肾脏的常用的两种细胞系，即人肾脏系膜细胞（Human mesangial cells,HMCs）和人近曲小管上皮细胞（Human proximal tubular cell,HK2）。选用了小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）瞬时转染建立了CD36 siRNA HMCs和HK2细胞的体外模型。进一步的用SAA1ug/ml处理CD36干扰的两种不同的细胞建立体外细胞AA淀粉样变模型。在SAA处理状态下，用自噬检测试剂盒观察干扰CD36对肾脏细胞自噬的影响。用自噬抑制剂wortman(200nmol/L）处理HK2细胞和HMCs细胞后分别分成4组：阴性对照组（NCi+SAA），CD36干扰对照组（CD36i+SAA）,实验对照+自噬抑制剂组（NCi+SAA+wortman），CD36干扰对照+自噬抑制剂组（CD36i+SAA+wortman）。免疫荧光检测HK2细胞内AA的沉积状况。Q-PCR检测HK2细胞和HMCs细胞的炎症和纤维化基因表达情况。再用AMPK抑制剂Compound C(10umol/L)分别处理HK2和HMCs细胞，将其分为4组：阴性对照组（NCi+SAA）,CD36干扰对照组（CD36i+SAA），阴性对照+AMPK抑制剂组（NCi+SAA+Compound C)，CD36干扰对照+AMPK抑制剂组（CD36i+SAA+Compound C）。用自噬检测试剂盒检测自噬，用Q-PCR检测LC3的表达。以自噬强度和LC3的表达来评价抑制AMPK活性对SAA作用下HK2和HMCs的影响。
　　结果：
　　第一部分：Casein皮下注射能上调WT小鼠血清中血清淀粉样蛋白A（serum amyloidA，SAA)的含量。刚果红染色和电镜结果显示Casein能够诱导WT小鼠肾脏发生淀粉样变；免疫组化和Western blot结果均显示在Casein诱导的淀粉样变小鼠中CD36的表达是上调的。
　　第二部分：刚果红染色在光镜和偏振光下观察到CD36缺失能改善Casein诱导的小鼠肾脏淀粉样变；而高锰酸钾处理后的刚果红染色三组均为阴性，说明了在本实验中Casein所诱导的肾脏淀粉样变是AA型的淀粉样变。另外我们的透射电镜结果也可看到WT Casein(+)组小鼠肾脏有明显的淀粉样纤维沉积，而CD36-/-Casein（+）组和WT Casein(-)组没有观察到。血尿检测显示WT Casein（+）组小鼠表现出明显的肾病综合征症状，即尿量增多，大量蛋白尿，明显的低蛋白血症和高脂血症等，而CD36-/-Casein（+）组小鼠肾功能有改善。H&E、MASSON染色、Western blot和Q-PCR结果均显示CD36-/-Casein(+)组小鼠肾脏纤维化和炎症水平较WT Casein(+)组明显减轻。
　　第三部分：动物实验；TEM观察到CD36-/- Casein(+)组肾小管区自噬小体较WT Casein(+)增多；CD36-/-Casein(+)组肾脏组织的AA沉积减少而LC3的表达是上调的，且AA沉积的部位和LC3表达的部位能够重叠。WT Casein(+)组较CD36-/-Casein(+)组小鼠肾脏组织内p-AMPK表达水平明显降低，且CD36-/-Casein(+)组肾脏组织LC3的表达较WT Casein(+)增高。细胞实验：同时给与SAA处理后，CD36i组较NCi组的自噬明显增加，AA积聚减少，细胞炎症和纤维化指标表达下调的；自噬抑制剂wortman处理后,NCi组和RNAi组的上述指标改变都无明显差异。另外在AMPK抑制剂Compound C的处理下NCi组和RNAi组的自噬表达明显下降，且两组无显著差异。
　　结论：
　　1、Casein能诱导 WT小鼠肾脏淀粉样变的发生，同时伴有CD36蛋白的异常高表达。
　　2、CD36参与了Casein诱导的小鼠肾脏AA淀粉样病变及组织损伤；CD36的缺失能够明显改善肾脏组织淀粉样纤维的沉积及肾脏损害。
　　3、CD36的缺失可能上调自噬的产生而清除过多的SAA发挥保护肾脏的功能。
　　4、CD36的缺失上调自噬可能与激活AMPK上调LC3的启动子活性有关。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分CD36在肾脏淀粉样变肾组织中的表达及意义

1 实验材料和方法

2实验结果

讨论

第二部分 CD36缺失对肾脏AA淀粉样变及其肾脏损伤的影响

1实验材料和方法

2实验结果

讨论

第三部分 CD36缺失改善肾脏AA淀粉样病及其肾脏损伤的作用机制探讨

第一节抑制 CD36缺失对体内外自噬的影响

第二节 SAA刺激下CD36 siRNA 对体外AA 细胞损害的影响

第三节 抑制 CD36调控AMPK在肾脏AA淀粉样变中的作用研究

讨论

全文总结

文献综述:肾脏AA淀粉样变性的相关进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文和参加的会议