代谢组学技术在代谢性疾病及氨基酸检测方面的应用

摘要

背景：代谢组学（metabolomics）作为系统生物学的一个分支，能够用于分析生物体内的内外源性的代谢产物的变化，近年来屡被用于发现疾病代谢通路的改变，寻找诊断疾病的标志物，揭示研究对象所处的生理和病理状态。相关代谢组学技术，例如气相色谱、液相色谱或色质联用方法等，也常用于氨基酸、脂质等小分子物质的检测。近年来，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver, NAFLD）在世界各国的发病率不断提高。虽然该病常合并肥胖、2型糖尿病等代谢综合征，但是值得注意的是，该病在非肥胖人群中也有较高的发病率。此病的发病机制尚不十分明确，各种诊断手段都有其弊端，且无有效的治疗药物。因此，寻找该病的诊断标志物，分析代谢通路的改变，探讨其发病机制，具有十分重要的意义。
　　目的：⑴基于超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（Ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-Q-TOF-MS）研究平台，利用非肥胖的NAFLD患者和年龄、体重指数（Body mass index, BMI）相匹配的健康对照人群的血清，进行非靶标的代谢组学研究，筛选两组间的差异性代谢产物，发现可以做为NAFLD另外一种特殊诊断手段的代谢物，探讨与疾病相关的可能的发病机制，为该病的治疗提供些许思路。⑵利用气相色谱质谱(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)衍生化法对生物样本中的非极性氨基酸进行定量检测；探讨疾病组与正常对照组中非极性氨基酸的差异及其意义。
　　方法：①利用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC/Q-TOF-MS）的平台，应用代谢组学的方法，结合现代分析方法，研究NAFLD患者(n=24)和健康对照组（n=22）之间的内源性代谢物发生的变化。采用软件MarkerView v1.2.1对实验的原始数据进行提取和归一化处理，运用Metaboanalyst3.0软件做主成分分析（Principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal partial least-squares discriminant analysis, OPLS-DA）。根据SIMCA-P13.0软件分析中的标量投影重要性（Variable importance in projection, VIP）值，结合单变量统计分析中的 P值，对 NAFLD患者和健康对照人群差异性离子进行选择，并且进行鉴定。利用Metaboanalyst3.0软件对鉴定出的差异性代谢物质进行代谢通路的分析，采用受试者工作曲线（Receiver operating characteristic, ROC）对代谢物的临床诊断效能进行评价。②取100μL羊水上清液，加入甲醇去蛋白后提取上层清液吹干，进行MSTFA衍生化，利用GC-MS检测并分析检测结果。
　　结果：⑴非肥胖的NAFLD患者和健康对照组代谢物的表达模式，在PCA和 OPLS-DA分析模型中均能很好的区分开来。在两组之间鉴定出了17种具有统计学差异的代谢物，这些物质包括类固醇激素及其衍生物，脂肪酸酯，羧酸及其衍生物，苯及其衍生物，尿酸等。与健康对照组相比，NAFLD患者代谢物水平升高的有：亮氨酸、正亮氨酸，鹅去氧胆酸，牛磺胆酸，左旋肉碱，花生四烯酸，脯氨酸，高龙胆酸，尿酸，肌酸酐，7,8-Dehydroastaxanthianthin，羟基丁酸，谷氨酸。比正常对照组下降的物质有棕榈油酸，棕榈酰胺，3-苯氧基苯甲酸，甜菜碱。同时，非肥胖的NAFLD患者的代谢通路亦发生了异常，这其中包括：丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢通路，花生四烯酸酸代谢通路，精氨酸-脯氨酸代谢通路，谷氨酸盐代谢通路。⑵该方法具有良好的灵敏度、精密度、准确度以及回收率。在最优化的检测条件下，被检测氨基酸最低检出限为0.12~0.38 mg/L，线性范围为0.5~10 mg/L，添加回收率在91%~104%之间，日内及日间相对标准偏差（RSD）在0.84%~9.33%之间。用建立的方法对17例疾病组和13名正常组孕妇的羊水样本进行测定，统计分析结果表明，疾病组孕妇羊水中亮氨酸和异亮氨酸含量显著降低（P＜0.01），其余3种氨基酸水平无明显差异。
　　结论：①利用代谢组学的研究方法，本研究发现非肥胖的NALFD患者体内存在着多种内源性代谢物的改变。本研究获得的结果对于我们深入理解非肥胖NAFLD的发病机制有重要的意义。同时，对临床工作者在该病的诊断及治疗提供参考依据。②本方法经方法学验证，可作为羊水中氨基酸含量的测定方法，具有良好的应用前景；亮氨酸的减少可能参与了先天性畸形的发生。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

第一部分 非肥胖人群中非酒精性脂肪性肝病的血清代谢组学研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4结语

参考文献

第二部分GC-MS衍生化法检测生物样本中的非极性氨基酸

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

文献综述:非酒精性脂肪性肝病的代谢组学研究进展

致谢

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