2ʹ,5ʹ-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀途径检测eNOS O-GlcNAc糖基化的方法学研究

摘要

目的：研究通过2?,5?-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀法富集内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）后检测eNOS氧连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linked Nacetylglucosamine，O-GlcNAc）糖基化表达的方法及该方法在2型糖尿病大鼠模型中的应用。 方法：检测2?,5?-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀法在牛主动脉内皮细胞（Bovineaortic endothelial cells，BAECs）总蛋白裂解液中对eNOS的富集效率；蛋白质印迹法（Western blot）结合抗O-GlcNAc一抗检测BAECs及大鼠主动脉组织蛋白中eNOS O-GlcNAc糖基化的表达水平；2型糖尿病大鼠模型的建立；前述方法应用于2型糖尿病大鼠主动脉组织的eNOS O-GlcNAc糖基化表达水平的检测。 结果：2?,5?-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀法在 BAECs总蛋白裂解液中对eNOS的富集效率大于80%；BAECs和大鼠主动脉组织总蛋白裂解液中的 eNOS经过2?,5?-ADP-琼脂糖凝胶亲和沉淀法富集后，eNOS O-GlcNAc糖基化的表达量与BAECs和大鼠主动脉组织蛋白总量成正比例的线性关系，证明在一定蛋白总量范围内，该方法有效；糖尿病组大鼠的空腹血糖和胰岛素抵抗指数均高于正常组（P＞0.05），体重低于正常组（P＞0.05）；糖尿病组大鼠主动脉组织中的eNOS O-GlcNAc糖基化表达水平相比正常组有明显上调（P＞0.05）。 结论：相比免疫沉淀的方法，通过2?,5?-ADP-琼脂糖凝亲和沉淀的途径检测eNOS O-GlcNAc糖基化表达的方法更简单、高效、并能有效的应用于内皮细胞以及正常或疾病动物模型中的主动脉组织。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料和方法

1.1实验动物

1.2实验细胞

1.3主要试剂

1.4主要仪器

1.5实验方法

1.6Western Blot

1.7统计分析

2实验结果

2.1 2′,5′-ADP-琼脂糖凝胶富集eNOS的效率

2.2 BAECs中eNOS O-GlcNAc糖基化的表达

2.3大鼠主动脉组织中 eNOS O-GlcNAc糖基化的表达

2.4各组大鼠相关数据指标变化

2.5糖尿病大鼠主动脉组织中eNOS O-GlcNAc糖基化表达水平的变化

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:内皮型一氧化氮合酶的结构功能与心血管疾病

致谢

硕士期间发表的文章