晚期糖基化终产物通过Akt/eNOS途径调节内皮祖细胞功能研究

摘要

[研究背景及目的] 内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞,即能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞,又称血管母细胞(angioblast)或血管内皮干细胞(endothelial stem cells)。1997年由Asahara等首次分离,并证实人类出生后的外周血循环中存在有能分化为血管内皮细胞的EPCs,它在机体的血管新生和内皮损伤修复中起重要作用。近年来的研究表明EPCs在冠心病的发生、发展中扮演了重要角色,外周血EPCs数量减少、功能障碍预示血管内皮修复能力降低,心血管疾病发生率增高。 糖尿病是冠心病的等危症,在糖尿病患者中,动脉粥样硬化(AS)等慢性血管并发症已成为主要致残和致死原因。研究表明糖尿病患者外周血中EPCs数量较正常人减少,进一步研究表明晚期糖基化终产物(AGEs)在糖尿病致动脉粥样硬化发生发展过程中起着重要作用。因此体外研究AGEs对EPCs的影响也有同样的意义。先前的工作研究了AGEs通过p38MAPK途径影响EPCs的功能,本研究继续探讨AGEs是否也通过P13K/AM/eNOS通路调节EPCs的功能。 通心络是依据中药络病理论研制的具有益气活血、通络止痛,使气旺血行、脉络畅通功效的中成药物。已有研究证实通心络能显著改善冠心病患者血管内皮功能,延缓AS进程,改善冠心病心绞痛症状,我们研究通心络对该通路的影响,进一步探讨通心络的作用机制。 [实验方法] 一、人外周血EPCs的培养及鉴定 取健康成人自愿者外周血,用密度梯度离心法分离出单个核细胞,将其接种于预先包被有人纤连蛋白六孔板培养皿中,含rh-VEGF、rh-bFGF、10％的胎牛血清M199培养液培养4天,PBS洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7天,继续使用PBS浸洗掉非贴壁细胞,贴壁细胞通过激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和Dil-acDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,并进一步通过流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD133、VEGFR-2的表达。 二、AGEs对EPCs p-Akt、p-eNOS蛋白表达的影响 第8天同步化处理,按不同浓度AGEs和预干预因素(抗RAGE中和抗体、罗格列酮、通心络)分组,采用Western-blot检测Akt、p-Akt、p-eNOS蛋白的表达。用image-pro plus6.0软件进行定量分析,将各组所得的灰度值p-Akt/Akt、p-eNOS/β-actin相比,再以空白组值为分母相比的百分比。研究不同浓度和预干预因素对P-Akt、P-eNOS蛋白表达的影响三、AGEs和L-NAME、LY294002对EPCs功能影响第8天同步化处理,分空白对照、AGEs、RAGE中和抗体、罗格列酮、通心络、SNP,L-NAME、LY294002组。Transwell小室法检测细胞迁移,CCK-8试剂盒检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡、总NO试剂盒检测NO生成、人VCAM-1ELISA试剂盒检测VCAM-1表达的情况。 [实验结果] 一、EPCs的培养及鉴定 培养4天后,可见典型细胞集落,7天后形成了梭形的内皮样细胞。用Dil-acLDL和FITC-UEA-I对细胞染色后,通过激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。流式细胞仪示贴壁细胞表达CD133阳性率在0.855±0.050;VEGF-R2阳性率0.826±0.053;CD34阳性率0.823±0.072。 二、AGEs对EPCsAktP-Akt、P-eNOS蛋白表达的影响研究 随着AGEs浓度的增加各组EPCsAkt蛋白表达无统计学差异,P-Akt、p-eNOS蛋白表达减少,100μg/ml AGEs组p-Akt/Akt比值较空白对照组下降34.5％、p-eNOS/β-actin下降56.3％,200μg/ml AGEs组p-Akt/Akt比值较空白对照组下降66.7％、p-eNOS/β-actin下降84.3％,200μg/ml AGEs组加入抗RAGE中和抗体、罗格列酮、通心络预干预后,P-Akt/Akt比值分别较200μg/ml AGEs组上升56.2％、53.8％、30.7％；p-eNOS/β-actin比值分别较200μg/ml AGEs组上升55.1％、46.8％、25.6％。 三、AGEs对EPCs功能影响的研究 200μg/ml AGEs组可以显著促进EPCs的凋亡,空白组为4.6％,AGEs组为15.2％,L-NAME和LY294002分别为16％和16.9％,AGEs组加入SNP、抗RAGE中和抗体、罗格列酮、通心络预干预后凋亡率减少。AGEs也可增加VCAM-1的表达,降低EPCs迁移、黏附、增殖、NO生成能力。 [结论] 一、采用密度梯度离心法可成功从人外周血中分离和培养血管EPCs。 二、AGE-HSA促进EPCs的凋亡,抑制EPCs的增殖,并促进其分泌VCAM-1,降低EPCs迁移、黏附、增殖、NO生成能力。 三、AGEs可通过Akt/eNOS信号通路途径影响EPCs的功能。 四、SNP、抗RAGE中和抗体、罗格列酮、通心络可部分抑制AGEs的作用。

目录

论文说明：主要英文缩略词表

声明

摘要

前 言

第一部分成人外周血内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

一、材料与方法

二数据分析与统计

三结果

四讨论

第二部分AGEs对EPCs p—Akt、p-eNOS蛋白表达的影响

一材料与方法

二.数据分析与统计

三．结 果

四、讨 论

第三部分晚期糖基化终产物对内皮细胞功能的影响

一．材料与方法

三结 果

四讨 论

论文总结

参考文献

支架内再狭窄的与内皮祖细胞的分型

致 谢