柚皮苷对共存的成骨细胞和破骨细胞综合效应的机制研究

摘要

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种骨骼强度减弱，易于骨折的疾病，影响全世界数以百万计的人。骨质疏松症的治疗方法通常包括药物治疗和干预措施，比如矿物质的补充，改变生活方式和加强运动锻炼等。鉴于中药副作用小，治疗成本较低的优点，使得其被广泛应用于临床实践，已有2000多年历史。骨碎补具备补肾强骨之功效，能促成骨质愈合，治疗骨质疏松。柚皮苷是骨碎补的主要活性物质，为单一的化学成分。有研究表明，柚皮苷具备促成成骨细胞增殖和分化以及减少破骨细胞形成的双重作用，并且还能抑制药物诱导的OP。因而我们推测具有双重作用的柚皮苷可在减少破骨量的同时增加成骨量，从而能纠正OP状态下成骨细胞和破骨细胞之间的失衡，起到抗OP的效果。在本次实验中，我们将围绕上述展开研究，主要部分分述如下：
　　1.柚皮苷作用后，成骨细胞增殖，分化的改变
　　（1）目的研究柚皮苷作用下，乳鼠原代培养的颅顶骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts，ROB)增殖，分化，成熟的改变。
　　（2）方法实验对象为出生4天的乳鼠颅顶骨，二次酶消化法获取原代成骨细胞，3d换液1次，待细胞融合80%后传代。采用不同浓度的柚皮苷进行药物干预，CCK-8法检测成骨细胞的增殖率，同时检测不同浓度柚皮苷作用不同时间点的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性，茜素红染色显示钙化结节。Elisa法检测柚皮苷组，对照组之间的骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(oesteopontin，OPN)的蛋白水平是否有所不同;Realtime RT-PCR检测成骨细胞相关因子ALP，OCN,OPN的 mRNA水平。
　　（3）结果:柚皮苷作用后，CCK-8检测结果发现成骨细胞的增殖具有明显增加。当1mg/L浓度组培养至第3D时，细胞增殖开始出现差别（P＜0.05），培养至9D时，增殖最为明显（P＜0.01）。10mg/L浓度组在培养至9D时，也表现出了促增殖的效果（P＜0.05）。ALP染色后，柚皮苷处理组呈现出更高的ALP活性。药物浓度为1mg/L时，柚皮苷明显提高OCN，OPN的分泌量。PCR结果也显示，柚皮苷作用后，成骨相关的因子ALP, OCN,OPN mRNA的表达得到了促进。
　　（4）结论柚皮苷有助于促进ROB的增殖与分化成熟，药物浓度为1mg/L时作用更为明显，并且存在时间相关性，对于骨质疏松症的防治有一定的作用。
　　2.鼠颅顶骨器官培养中，柚皮苷对成骨细胞和破骨细胞的影响
　　（1）目的建立骨器官培养模型初步研究柚皮苷调解共存的骨细胞之间平衡状态的作用机制
　　（2）方法取出生4天鼠颅顶骨，分离出颅顶骨，于α-MEM培养。采不同浓度柚皮苷作用后，HE染色，TRAP染色，钙离子浓度检测，PCR检测细胞相关因子OPG,RANKL的mRNA水平。
　　（3）结果柚皮苷作用下，HE染色后新骨生成有明显的增加，切片骨厚度可见明显增加，成骨细胞计数结果提示以1mg/L增加最为显著（P＜0.05），其次为10mg/L浓度组。柚皮苷处理后，随着时间的推移，骨器官的TRAP染色越来越浅，表明破骨细胞着色数量有减少的趋势，破骨细胞计数结果提示以1mg/L减少最为显著（P＜0.05）。RT-PCR结果显示，柚皮苷作用组，成骨分化基因OPG的表达增加（P＜0.05），破骨分化基因RANKL的表达有所减少（P＜0.05）。
　　（4）结论采用骨器官培养模型研究发现，在共培养时，柚皮苷具有促进成骨的作用，同时也具有抑制破骨的效应，其机制与RANKL/OPG/RANK有一定关系。
　　3.将显微CT和骨器官培养技术结合起来用于中药的研究
　　（1）目的采用显微CT扫描技术，对柚皮苷对共存的成骨细胞和破骨细胞的影响进行纵向研究和分析
　　（2）方法体外建立骨器官模型，分为三组，不同浓度柚皮苷作用后，于不同时间点进行体外Micro-CT的扫描，三维重建后，相关参数分析。
　　（3）结果不同时间点定量测量的不同浓度柚皮苷作用下的颅骨BS值与对照组比较，几乎无明显变化，只有在第16天，23天的时候，1mg/L浓度组与对照组之间差别有统计学意义（P＜0.05）。于不同时间点定量测量的不同浓度柚皮苷作用下的颅骨BV值，BS/BV与对照组比较，随着时间的延长有明显变化，差异有统计学意义（P＜0.05）,在第16天，23天的时候，所有组均呈现时间效应，出现统计学意义，即骨体积都增长明显。1mg/L浓度组与对照组之间差别明显有统计学意义（P＜0.01）。10mg/L浓度组与对照组之间差别具有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.结论：经过参数分析后，我们能够发现柚皮苷作用下，颅顶骨厚度有所增加，在共培养时，柚皮苷具有促进成骨的作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一章 柚皮苷对原代培养的成骨细胞增殖分化的影响

1引言

2 材料与方法

3 结果

4 本章讨论

5 本章小结

第二章 采用骨器官培养模型研究柚皮苷调解共存的骨细胞之间平衡状态的作用机制

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 本章讨论

5 本章小结

第三章 显微CT分析柚皮苷对骨形成和骨吸收的影响

1 引言

2 材料与方法

3 实验结果

4 本章讨论

5 本章小结

全文总结

参考文献

文献综述：Micro-CT的主要研究应用

致谢

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