血管平滑肌细胞特异性敲除SCAP通过ROS/AMPK途径激活自噬改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的研究

摘要

目的：固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)裂解激活蛋白(SCAP)又被称为胆固醇敏感器，能够感知细胞内胆固醇的浓度，调节细胞胆固醇的摄取和合成。研究证明平滑肌细胞在动脉硬化斑块中可以转化为泡沫细胞，我们的前期工作发现SCAP可能在其中扮演重要的角色，因此我们选用的致动脉粥样硬化小鼠模型APOE-/-小鼠，采用Cre-Loxp系统敲除血管平滑肌SCAP基因，试图在体内证明SCAP在动脉粥样硬化过程中平滑肌泡沫化的机制。然而在繁殖过程中，发现纯合子不能出生，因此我们采用SCAP敲除杂合子作为研究动脉粥样硬化的动物模型。 方法：1)体内实验：本实验将平滑肌特异性表达Cre酶的转基因雄性小鼠（SM22-Cre）与雌性SCAPflox/flox小鼠交配，通过繁殖筛选，得到SM22-Cre;SCAPflox/+转基因小鼠，并与ApoE-/-小鼠交配繁殖，并筛选出SM22-Cre;SCAPflox/+;ApoE-/-转基因小鼠，通过PCR鉴定基因型，并通过荧光定量PCR、免疫组化、western blot等鉴定SCAP敲低的程度与特异性。筛选出来的小鼠喂养高胆固醇饮食12周，脱颈处死取血清及血管进行后续实验。血管整体及切片进行油红O染色，观察动脉粥样硬化斑块形成情况；检测血浆胆固醇酯(CE)和游离胆固醇(FC)的水平；血管根部切片做H.E.染色，观察动脉粥样硬化斑块内坏死中心面积；Masson三色法染色及小天狼星红染色检测斑块内胶原纤维的生成情况；Tunel染色检测斑块内细胞凋亡的情况；免疫组织化学检测斑块内平滑肌特异性标志物α-SMA及巨噬细胞特异性标志物CD68的表达，免疫组化检测LDLr、HMGCoAR、SREBP2、P62、LC3、p-AMPK等蛋白的表达情况；激光共聚焦检测斑块内α-SMA与LC3的表达及共定位情况；DHE(Dihydroethidium)检测组织内活性氧的含量；2）体外实验：siRNA转染血管平滑肌细胞并Loading LDL24h， RT-PCR及Westernblot检测LDLr、HMGCoAR、SREBP2、SCAP mRNA及蛋白水平，炎症转染效率；油红O染色检测细胞内脂质沉积情况；MDC法检测细胞内自噬小泡的形成；DHE检测细胞内活性氧的生成；Western blot检测AMPK、p-AMPK、LC3、P62等蛋白的表达含量；过氧化氢（H2O2）处理细胞，检测细胞内p-AMPK/AMPK比值；AMPK抑制剂compound C处理细胞检测细胞p-AMPK/AMPK比值，LC3、P62等蛋白的表达含量，及细胞内自噬和脂质积聚的情况。 结果:1.我们利用Cre/Loxp系统获得SM22-Cre;SCAPflox/+;ApoE-/-小鼠，通过RT-PCR、Western blot检测SCAP mRNA及蛋白水平证明模型可用。 2. SCAP敲低小鼠与对照组均有明显粥样斑块形成，但SCAP敲低小鼠组小鼠动脉粥样斑块的面积明显减小，同时斑块内坏死中心、巨噬细胞浸润、斑块内凋亡均较对照组明显减少，同时斑块内的胶原生成及纤维帽的形成明显增多，这个结果表明SM22-Cre;SCAPflox/+;ApoE-/-较对照组拥有较小的、更稳定的动脉粥样硬化斑块。 3.结果表明，在平滑肌特异性敲低SCAP能够上调细胞内自噬的水平，这一现象在体外实验人血管平滑肌细胞上得到了验证。 4.体外实验及体内实验表明，在SCAP信号被敲低的时候，能够明显的降低斑块和细胞内的ROS水平，改善AMPK的活性，因此可以推断血管平滑肌特异性敲低SCAP能够上调细胞内自噬是通过激活AMPK活性引起的。 5.加入AMPK抑制剂后，SCAPsi不能上调细胞自噬和改善细胞内脂质积聚，进一步验证SCAP敲低通过激活自噬改善细胞内脂质积聚是通过AMPK作用的。 结论：在血管平滑肌细胞中特异性敲低SCAP能通过减少细胞内活性氧的产生、改善APMK活性进而激活自噬，改善平滑肌细胞内脂质积聚，抑制其泡沫细胞的形成，最终减轻动脉粥样硬化的发生。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分血管平滑肌特异性敲除SCAP杂合子减轻ApoE-/-动脉粥样硬化斑块的形成

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分SCAP+/-小鼠通过缓解AMPK活性损伤激活自噬

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:氧化应激与动脉粥样硬化

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

攻读博士研究生期间参加的学术会议