舒芬太尼通过ERK1/2信号通路对心肌缺血/再灌注损伤保护作用的机制研究

摘要

目的：本研究以大鼠为研究对象，分为假手术组，缺血再灌注组和缺血再灌注+舒芬太尼组，建立大鼠的心肌缺血再灌注损伤模型，初步研究舒芬太尼对心肌缺血再灌注性损害的保护作用。为了进一步证明，以心肌细胞 H9C2为研究对象，构建缺氧复氧模型以模拟体内缺血再灌注损伤，对舒芬太尼在缺氧/复氧心肌细胞中的MAPK通路的作用进行研究，旨在找到舒芬太尼对心肌细胞的作用机制。同时为了证明ERK1/2的作用，用U0126（ERK1/2磷酸化抑制剂）将ERK1/2磷酸化抑制来研究舒芬太尼对缺血再灌注损伤的保护过程的变化。为临床上手术期合理选择麻醉镇痛药提供可能的实验理论依据。 方法： 第一部分： 选择Wistar大鼠20只，将大鼠随机分为假手术组（SO），缺血再灌注组（IR）和缺血再灌注+舒芬太尼组（SUF）。构建动物缺血再灌注模型。收集动物血清和心肌组织。TTC法染色测定大鼠心肌梗死面积；检测MDA、SOD、CK、LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性；提取心肌组织的蛋白。对蛋白通过western blot检测ERK1/2、JNK、p38和磷酸化的ERK1/2、磷酸化的JNK、磷酸化的p38的表达。并通过软件分析出ERK1/2、JNK、 p38的磷酸化情况。 第二部分： 培养H9C2心肌细胞，构建缺氧复氧模型，用CCK-8法检测终浓度为0、5、10、20μM舒芬太尼对缺氧/复氧H9C2心肌细胞作用12h、24h、36h和48h后细胞的增殖情况。用作用最明显的舒芬太尼浓度作用缺氧/复氧心肌细胞0、4、8和12h，收集细胞，用Western blot方法检测ERK1/2、JNK、p38和磷酸化的ERK1/2、磷酸化的JNK、磷酸化的p38的表达。并通过软件分析出ERK1/2、JNK、p38的磷酸化情况。 通过 CCK-8法检测不同浓度 U0126（ERK1/2磷酸化抑制剂）作用于H9C2心肌细胞时的生长情况，Western blot法检测ERK1/2磷酸化情况，确定U0126最佳浓度。用此浓度的U0126作用缺氧/复氧H9C2心肌细胞检测ERK1/2磷酸化情况，来确定U0126的作用效果。然后用此浓度的U0126同时加入10μM的舒芬太尼作用缺氧/复氧心肌细胞H9C2细胞，检测ERK1/2、p38、JNK和磷酸化的ERK1/2、p38、JNK在蛋白水平的表达量。用 CCK-8法检测缺氧/复氧心肌细胞的增殖情况。 结果： 第一部分： SO组没有发生心梗，IR组的梗死面积很大为51.71±3.21%，而SUF组梗死面积明显低于IR组，P＜0.05；结果表明在心脏组织中SUF组的显著低于IR组的CK、MDA、LDH、(P＜0.05)。而SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性则SUF组显著高于IR组(P＜0.05)。同时SUF组的与SO组的基本相同(P＞0.05)。SUF组的磷酸化的ERK1/2的表达量与IR相比，明显升高（P＜0.05）。同时SUF组的与SO组的基本相同(P＞0.05)。而其他蛋白均无显著变化。 第二部分： 随着时间的增长，缺氧/复氧 H9C2细胞的增长率逐渐变化，呈升高趋势，其中24h，36h的生长率显著高于12h（P＜0.05）,而36h与24h相比，也明显升高（P＜0.05）。在36h和48h，不同浓度的舒芬太尼作用于缺氧/复氧H9C2细胞的增长率则在0、5、10μM时随着时间的增加增长率也升高（P＜0.05），在20μM时的增长率与10μM的相差不大（P＞0.05）。在12h和24h，0μM和5μM的增长率没有差异（P＞0.05），但都显著低于10μM和20μM的增长率（P＜0.05）。在12h时，10μM和20μM的增长率没有差异（P＞0.05）。在24h时，10μM的增长率显著高于20μM的增长率（P＜0.05）。当舒芬太尼的浓度为10μM作用时间为36h时，缺氧/复氧H9C2细胞的的生长情况最佳。Western blot检测ERK1/2、p38、JNK和磷酸化的 ERK1/2、p38、JNK在蛋白水平的表达量。在0、4h、8h随着时间的增加磷酸化的ERK1/2的表达量逐渐升高（P＜0.05）。而在8h、12h在磷酸化的ERK1/2的表达量则没有显著差异（ P＞0.05）。而其他蛋白的条带在各个时间段均没有明显变化。（P＞0.05）。 为了进一步研究ERK1/2在舒芬太尼作用心肌细胞的过程，用0、10、20、30、40和50ng/ml的U0126作用于心肌细胞，发现心肌细胞生长速度明显降低，且在40ng/ml时最低，同时ERK1/2磷酸化水平也较低。40ng/ml的U0126对心肌细胞的作用最佳。用40ng/ml的U0126加入缺氧/复氧心肌细胞后，ERK1/2及磷酸化的ERK1/2在0、20、40、60、80min的表达量一致，且磷酸化的ERK1/2表达非常低。用40ng/ml的U0126同时加入10μM的舒芬太尼作用缺氧/复氧心肌细胞H9C2细胞，ERK1/2、p38、JNK和磷酸化的 ERK1/、2p38、JNK在蛋白水平的表达量，在0、4h、8h、12h随着时间的增加没有变化。在12、24、36和48h CCK-8法检测细胞增殖情况结果表细胞的增殖也变得较为缓慢。 结论： (1)舒芬太尼对于大鼠心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用，该保护作用可能有ERK1/2参与。 (2)舒芬太尼对心肌细胞H9C2缺氧/复氧损伤有保护作用，保护作用是通过ERK1/2途径实现的。

目录

声明

英汉缩略词对照

前言

第一部分 舒芬太尼对大鼠心肌缺血再灌注损伤MAPK通路表达的影响

1.材料与方法

2. 结果

讨论

第二部分 舒芬太尼对缺氧/复氧H9C2心肌细胞MAPK通路的作用

1.材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

1. 结论

2. 后续研究方向

参考文献

文献综述:心肌缺血再灌注损伤的机制

致谢

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