肿瘤型OATP1B3在卵巢癌发生发展中的作用及其机制研究

摘要

目的： 本研究首先检测肿瘤型OATP1B3（Cancer-type Organic Anion TransportingPolypeptide1B3,Ct-OATP1B3）在上皮性卵巢癌组织细胞中的表达及定位，分析其与卵巢癌发生发展及预后之间的关系；其次，在上皮性卵巢癌细胞株中观察Ct-OATP1B3的生物学功能，并探讨其分子机制。 方法： 1.免疫组织化学法检测Ct-OATP1B3在不同临床分期的上皮性卵巢癌组织中的表达水平，结合TCGA数据库，分析Ct-OATP1B3的表达与卵巢癌的发生发展及预后之间的关系。 2.选取人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3和OVCAR3，以人正常卵巢上皮细胞株HOSE作对照，采用Real-time PCR和细胞免疫荧光法观察Ct-OATP1B3在卵巢癌细胞中的表达及定位。 3.在上皮性卵巢癌细胞株SKOV3和OVCAR3的基础上，构建Ct-OATP1B3过表达和敲低细胞模型，采用CCK-8、流式细胞术、细胞划痕实验、细胞粘附实验以及 Transwell小室迁移实验等方法分析Ct-OATP1B3对卵巢癌细胞生物学行为的影响。 4.在正常对照Ct-OATP1B3过表达及敲低的SKOV3和OVCAR3细胞株中，利用Real-timePCR和Western blot方法分析Ct-OATP1B3对细胞中上皮标志物E-Cadherin和Keratin18及间质标志物Fibronectin和 FSP1表达水平的影响，从上皮细胞-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）角度初步探讨Ct-OATP1B3功能的分子机制。 结果: 1.本研究纳入了87例人正常卵巢上皮组织或上皮性卵巢癌组织标本，免疫组织化学染色结果显示，在正常卵巢上皮组织中未检测到Ct-OATP1B3的表达，即表达阳性率为0%；而在TNM分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期上皮性卵巢癌组织中，Ct-OATP1B3的表达水平显著上调，表达阳性率分别为25.0%、57.9%和83.3%（P＜0.05）。Ct-OATP1B3在各期卵巢癌组织中的平均表达水均显著高于正常卵巢组织：在Ⅲ期卵巢癌组织中的表达水平最高，显著高于Ⅰ期（P<0.01）和Ⅱ期（P＜0.05）；Ⅱ期与Ⅰ期相比，Ct-OATP1B3的表达水平仅有增加的趋势，但未达到显著性差异（P=0.8649）。在获得随访资料的54名卵巢癌患者中，Ct-OATP1B3表达阳性患者的总体生存率明显低于Ct-OATP1B3表达阴性患者（P<0.001）。TCGA数据库分析结果同样表明，Ct-OATP1B3表达水平随着卵巢癌患者临床分期的增高而增加，Ct-OATP1B3阳性表达患者比Ct-OATP1B3阴性表达患者的总体生存率明显降低（P<0.01）。 2.Real-time PCR实验结果显示，在正常卵巢上皮细胞HOSE中Ct-OATP1B3 mRNA表达量极低，而卵巢癌细胞OCVCR3和SKOV3中Ct-OATP1B3 mRNA水平明显增高，分别是HOSE细胞内Ct-OATP1B3 mRNA水平的687.9和591.7倍（P值均＜0.01）；细胞免疫荧光结果显示Ct-OATP1B3主要表达于卵巢癌细胞OCVCR3和SKOV3的胞质中。 3.细胞生物学行为实验发现，与对照组SKOV3与OVCAR3细胞相比，过表达Ct-OATP1B3后，细胞的生长增殖能力分别上调了1.134倍和1.114倍（P值均＜0.05），48h内的迁移率分别增加了2.03倍和1.65倍（P值均＜0.01），侵袭率分别增加了1.75倍和2.27倍（P值均＜0.01）；而敲低Ct-OATP1B3后，细胞的生长增殖能力分别下调了9.03%和9.34%（P值均＜0.05），48h内的迁移率则分别下调了51.3%和58.0%（P值均＜0.01），侵袭率分别下调了38.4%和41.7%（P值均＜0.01）。Ct-OATP1B3对卵巢癌细胞的凋亡和粘附能力没有显著影响。 4.与对照组SKOV3与OVCAR3细胞相比，Ct-OATP1B3过表达后，EMT上皮细胞标志物E-Cadherin在mRNA水平分别下调了70.3%和77.9%（P值均＜0.001），上皮细胞标志物Keratin18在mRNA水平分别下调了29.7%和36.4%（P值＜0.01，P值＜0.05），而间质细胞标志物Fibronectin在mRNA水平分别增加了4.38倍和6.13倍（P值均＜0.001），间质细胞标志物FSP1在mRNA水平分别增加了2.07倍（P值＜0.05）和1.19倍；Ct-OATP1B3敲低后，EMT上皮标志物E-Cadherin在mRNA水平分别增加了1.68倍和1.94倍（P值＜0.05，P值＜0.01），上皮细胞标志物Keratin18在mRNA水平分别增加了1.16倍和1.25倍，而间质细胞标志物Fibronectin在mRNA水平分别下调了60.7%和58.7%（P值均＜0.001），间质细胞标志物FSP1在mRNA水平分别下调了10%和16%。Western blot实验进一步验证结果显示，与对照组细胞相比，SKOV3与OVCAR3细胞过表达Ct-OATP1B3后，EMT上皮标志物E-Cadherin蛋白水平分别下调了23.2%和34.5%（P值均＜0.05），间质标记物Fibronectin蛋白水平分别增加了1.51倍和1.92倍，（P值＜0.05，P值＜0.01）；而SKOV3与OVCAR3细胞敲低Ct-OATP1B3后，EMT上皮标志物E-Cadherin蛋白水平分别增加了1.69倍和1.25倍（P值＜0.01，P值＜0.001），间质标记物Fibronectin蛋白水平分别下调了15.4%和31.2%（P值均＜0.01）。 结论： 与正常人上皮性卵巢组织细胞相比，Ct-OATP1B3在卵巢癌组织细胞中的表达显著上调，主要表达于细胞质中，与卵巢癌患者临床分期呈正相关，与患者总体生存率呈负相关；Ct-OATP1B3主要促进上皮性卵巢癌细胞的迁移侵袭能力，此外，对细胞的生长增殖能力也有微弱的增强作用；Ct-OATP1B3可能通过促进卵巢癌细胞EMT进程，从而对卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力产生重要影响。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 肿瘤型OATP1B3在卵巢癌组织细胞中的表达及其临床意义

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 肿瘤型OATP1B3在卵巢癌细胞中功能及其分子机制

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

文献综述:肿瘤型OATP1B3的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文