应用计算机辅助外科技术和3D打印技术修复犬下颌骨缺损的研究

摘要

背景： 目前临床上广泛采用自体骨移植来修复口腔颌面部骨组织的缺损，这种修复方式会造成移植供体部位组织的创伤，术者需要根据缺损的大小人工塑形，受主观因素影响较大，术后的外形往往无法达到患者的要求；同时，传统手术方式在切骨时存在切除范围过大或过小的可能。应用传统的颌面部修复手术，手术时间长，对主刀医生的水平要求很高，手术对患者的身心都会造成很大的影响。 计算机辅助外科技术、3D打印技术及组织工程修复技术的快速发展，为口腔颌面部骨组织的病变切除及缺损修复带来了新的可能。使用自体骨髓间充质干细胞(Autologous bone marrow mesenchymal stem cells，Auto-BMSCs)构建组织工程骨修复骨缺损的技术己比较成熟，计算机辅助外科技术和3D打印技术也开始初步的应用于骨缺损修复的临床治疗中。然而，能够打印生物支架材料的3D打印机较少，且使用价格比较昂贵，为今后我们进行研究及临床推广带来了困难。在组织工程骨的构建过程中，目前通常的方法为组织工程骨的种子细胞在体外扩增后，再与支架材料共同培养1至2周植入体内。传统的构建方法增加了植入组织工程骨之前的等待时间，同时加大了组织工程骨被污染的可能性。 目的： 本课题拟应用计算机辅助外科技术进行动物下颌骨缺损模型、手术导板及支架模具设计，采用3D打印技术快速打印手术导板及支架的模具，使用高温烧结法制作纳米多孔羟基磷灰石（Nano porous hydroxyapatite）支架材料，将Auto-BMSCs成骨诱导后与支架复合构建组织工程骨(Tissue engineered bone，TEB)，使用手术导板构建犬下颌骨缺损模型，将TEB植入犬下颌骨缺损部位，探索计算机辅助外科技术、低成本的3D打印技术应用于切除及修复大型哺乳动物下颌骨缺损的可行性及与传统手术方式的差异。探讨自体骨髓间充质细胞成骨诱导后与纳米多孔羟基磷灰石支架共同构建的TEB原位成骨能力，以及TEB不同构建时间之间是否存在成骨的差异。 方法： 1.从比格犬的髂骨处进行穿刺，抽取骨髓液，通过密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs），应用贴壁筛选法成骨诱导培养BMSCs，同时成脂诱导P2代的BMSCs，茜素红染色来检测BMSCs成骨诱导结果，油红O染色鉴定诱导成脂BMSCs的结果。 2.通过64排128层螺旋CT机扫描获得试验犬颌面骨的数据，利用计算机辅助外科进行比格犬下颌骨切除的设计，切除比格犬双侧下颌骨约长18mm宽9mm高5mm的骨组织，并设计手术导板、植入支架模具，根据设计采用3D打印技术，制作手术导板，支架的模具，采用高温烧结法制作纳米多孔羟基磷灰石支架材料。 3.将P2代成骨分化成功的犬auto-BMSCs与纳米多孔羟基磷灰石支架进行共培养，制作组织工程骨。组织工程骨分为2组：TEB8D（对照组）TEB体外共培养8天，TEB2D（试验组）TEB体外共培养2天。观察并分析成骨分化成功的BMSCs细胞在纳米多孔羟基磷灰石支架上增殖、生长的状态。 4.应用手术导板，切除比格犬的双侧部分下颌骨，构建下颌骨缺损模型。将比格犬的双侧下颌骨随机的分为3个实验组：1组（空白对照）植入空白纳米多孔羟基磷灰石支架材料，2组（对照实验）植入复合培养8天的组织工程骨，3组（实验组）植入体外共培养2天的组织工程骨。其中2组中随机选取1侧下颌骨，采用传统切除修复手术方法作为对照，了解采用计算机辅助外科技术及3D打印技术的手术方式在手术难度及修复精确度上与传统下颌骨切除修复手术是否存在差异。术后3个及6个月，对比格犬的颌面骨行CT检查，观察TEB的成骨及其降解的状况。术后9个月，手术取出支架材料，通过大体观察、电镜扫描、Micro-CT检查、硬组织切片及亚甲基蓝－酸性品红染色检查，以了解三个实验组的植入物与周围骨组织愈合、成骨、降解的情况。 结果： 1.从比格犬的骨髓液中提取足量的BMSCs，在体外成骨诱导培养后，BMSCs可迅速增殖、分化，成骨诱导的P2代BMSCs出现特异性的钙结节沉积。P2代BMSCs经过成脂诱导后，大量的脂滴出现在胞质中，证实我们提取的比格犬BMSCs经过成脂诱导，可分化为脂肪细胞，以此证实我们提取的比格犬BMSCs具有多向分化潜能。 2.我们通过CT扫描获得实验犬颌骨的数据，导入GeomagicFounda-tion2013软件生成了数字化三维图像。应用三维图像设计软件，设计了动物实验模型、手术指导导板以及植入材料的制作模具，并使用3D打印机快速、精准的打印出了手术指导导板以及材料的制作模具。使用打印出的模具，通过高温烧结法制作出了纳米多孔羟基磷灰石植入材料。 3.我们将成骨诱导分化后的自体BMSCs与纳米多孔羟基磷灰石复合培养制作组织工程骨，经过观察发现，TEB8D及TEB2D组，成骨诱导的P2代BMSCs接种支架，材料的外层，两组细胞均生长状态良好，增殖均迅速；材料的中间层，TEB8D组的BMSCs数目较多，TEB2D组的BMSCs少于TEB8D组。 4.我们采用计算机辅助外科技术的术前设计，使用手术导板构建了犬双侧下颌骨缺损模型，并精确的植入了支架；传统手术组，切除后缺损外形欠佳，材料需要临时塑形，手术时间明显延长，植入后肉眼见植入物与缺损基本吻合。通过取材时的观察及CT、Micro-CT检查显示，应用3D打印技术和计算机辅助外科技术的实验手术组，术后外形大体符合下颌骨的原有正常形态，而传统手术组出现材料与骨外形不匹配情况，说明虽然术中我们根据肉眼所见材料形状与缺损相似，但是实际植入后仍然存在偏差，导致材料成骨后外形出现异常。 5.2组（对照实验组）、3组（实验组）材料的密度术后3、6、9月时持续增加，9个月时与周围骨质密度相似，2组与3组间骨密度无显著性差异(P＞0.05)，1组（空白对照）的密度在术后3个月时与2组及3组无明显差别，而在术后6个月及术后9月的时候，1组密度持续降低，与2组及3组出现明显差异(P<0.0001)。术后9个月时标本大体观察、Micro-CT扫描显示，2组、3组的组织工程骨与周围骨组织愈合，可以保持下颌骨的完整性，1组（空白对照）显示材料未与周围骨组织愈合，缺损区由软组织填充。术后我们应用扫描电镜检测移植物后发现，2组和3组的TEB内,存在与哈弗氏管类似结构，并且我们还发现材料内出现矿物质晶体及大量的胶原纤维有序排列，同时，1组材料的表面只发现少量梭形、多角形的细胞，未见材料有明显的成骨迹象。亚甲基蓝－酸性品红染色显示，2组、3组的TEB内可以观察到哈弗氏系统样结构，红色的骨组织，排列有序的骨细胞，在缺损的边缘与周围下颌骨之间形成了骨性愈合。1组的材料内含有微量的骨组织，支架明显降解。 结论： 1.相比目前临床上广泛应用的手术切除方法，计算机辅助外科能够在手术术前根据检查设计个性化的手术切除范围，配合3D打印的手术导板，可以保证术中按照术前设计快速、精确的切除病变骨组织。 2.通过计算机辅助外科来设计与缺损完全吻合的个性化植入物模具，应用3D打印机快速制作，使用传统高温烧结法制作支架，方便，快速，费用低廉，精度高；与传统骨缺损修复技术相比，手术时间变短，难度降低，外形更加符合正常骨形态。适用于我们今后对TEB的研究和临床应用的推广。 3.我们的实验表明，成骨诱导后的BMSCs是合格的种子细胞，在组织工程骨形成过程中是不可或缺的。纳米多孔羟基磷灰石与种子细胞及比格犬的骨组织都有良好的相容性，能够促进成骨诱导后的BMSCs细胞的生长、增殖，适合做为支架应用于骨缺损的修复。 4.成骨诱导后的BMSCs复合纳米多孔羟基磷灰石支架材料构建组织工程骨时，复合培养8天与2天在体外培养时支架中心部位细胞数量存在差异，但在体内，两组间未发现存在显著性差异。证实，种子细胞与支架材料在体外的共培养时间能够缩短至2天。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 骨髓间充质干细胞的获取及培养研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 3D打印技术及计算机辅助外科技术在犬下颌骨缺损建模和修复的设计及制作中的应用研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 构建组织工程骨修复比格犬下颌骨骨缺损的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

附图

文献综述:3D打印在构建组织工程骨中应用的研究进展

致谢

博士期间发表的论文