黄颡鱼两种类固醇合成酶复制基因部分cDNA的克隆及EE2对其表达的影响

摘要

性类固醇激素在硬骨鱼的性别分化、繁殖和生长等过程中都扮演着极其重要的角色，特别是雌激素在性别分化和性成熟过程中起决定性作用。而 P450c17和20β-HSD在合成鱼类性类固醇激素和孕激素的过程中不可或缺。本研究通过RT-PCR及 RACE方法，从三峡库区重要的经济养殖鱼类——黄颡鱼中克隆了P450c17和20β-HSD的复制基因：P450c17α-II和20β-HSD-I的部分cDNA序列。序列分析结果发现，P450c17α-II和20β-HSD-I片段长度分别为1203bp和1198bp。多重序列对比显示，黄颡鱼P450c17α-I、-II均具有P450c17保守的Ono序列、十三肽和血红素结合区域。20β-HSD-I、II均具有20β-HSD保守的辅酶结合区域、辅酶腺苷酸接合位点、稳定β-折叠的结构、部分激活位点、底物接合位点、催化部位和酰胺烟酰胺环结构。相似性分析表明，黄颡鱼 P450c17α-I、-II均与同为鲇形目的斑点叉尾鮰和南方鲶相似性最高，与四足类相似性较低。20β-HSD-I、-II与斑点叉尾鮰和革胡子鲶相似性最高，与四足类相似性较低。随后，本研究还对上述基因的表达模式进行了研究，结果表明，黄颡鱼P450c17α-I、-II在精巢和卵巢中均有表达，且P450c17α-II在头肾中也有表达；而20β-HSD-I、-II呈现的是泛表达模式，在多种组织均有表达。季节表达模式研究结果表明，黄颡鱼雄鱼和雌鱼P450c17α-I在1月表达量最；20β-HSD-I在11月表达量最；而 P450c17α-II、20β-HSD-II在5月表达最高。
　　随着现代人类日常活动的日益频繁，内分泌干扰物带给人类和动物健康的影响也越来越大，关注度也随之增加。其中，对具有类雌激素效应药物的研究已逐渐成为热点。本研究用类雌激素——乙炔基雌二醇（EE2，100ng/L）对黄颡鱼（全雄）进行暴露处理（7、14和28天）。处理结束后，用组织学和半定量 RT-PCR（Semi-quantitative RT-PCR）研究了 EE2对黄颡鱼雄鱼性腺发育和精子发生的影响，及P450c17α-I、-II和20β-HSD-I、-II mRNA的表达变化，所得结果和结论如下：EE2暴露处理后黄颡鱼的精巢受到严重影响（暴露后14、28天），表现为性腺发育和精子发生延迟、停止，并出现生殖细胞大量减少，体细胞明显增生的现象。基因表达的研究发现，EE2处理后P450c17α-I，-II和20β-HSD-I的表达均被明显抑制，且呈时间依赖性；而20β-HSD-II表达无明显变化。

目录

1 绪论

1.1 性类固醇激素的研究进展

1.1.1性类固醇激素在脊椎动物中的作用

1.1.2性类固醇激素在鱼类中的作用

1.1.3 鱼类两种类固醇合成酶复制基因的研究进展

1.2 EDCs的种类及危害

1.2.1 EDCs的种类

1.2.2 EDC对鱼类的危害

1.3 三峡库区EE2的污染现状及其作用

1.4 长江流域的主要经济鱼类——黄颡鱼

1.4.1 黄颡鱼的生物学特征

1.4.2 黄颡鱼的研究现状

2 黄颡鱼两种类固醇合成酶复制基因cDNA的克隆与系统进化分析

2.1 实验材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.1.3黄颡鱼几种类固醇合成酶基因的组织表达模式

2.1.4季节表达模式的研究

2.1.5黄颡鱼几种类固醇合成酶基因系统进化和相似性分析

2.2 结果

2.2.1 P450c17α-I 和-II cDNA序列和系统发生分析

2.2.2 20β-HSD-I和20β-HSD-II cDNA序列和系统发生分析

2.2.3 几种类固醇合成酶基因在黄颡鱼的组织表达模式

2.2.4 季节表达模式

2.3 讨论

2.3.1 P450c17α-I 和P450c17α-II 序列分析和系统发生分析

3.2.2 20β-HSD-I和20β-HSD-II 序列分析和系统发生分析

2.3.2 类固醇合成酶的组织表达模式

2.3.3季节表达模式的分析

3 EE2对黄颡鱼精巢发育和P450c17/20β-HSD复制基因表达的影响

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物与材料

3.1.2 实验处理

3.2 实验方法

3.2.1 石蜡切片制作过程

3.2.2 EE2对两种类固醇合成酶复制基因表达量的影响

3.3 实验结果和分析

3.3.1 EE2对黄颡鱼性腺发育的影响：

3.3.2 EE2对黄颡鱼雄鱼P450c17α-I和P450c17α-II表达的影响

3.3.3 EE2对黄颡鱼雄鱼20β-HSD-I和20β-HSD-II表达的影响

3.4 讨论

4 结论：

参考文献

附录A：作者攻读硕士学位期间发表论文及科研情况

附 录B

致谢

声明