汞暴露对斑马鱼脊柱发育的影响研究

摘要

汞是一种非必需、易富集、高毒性，具有“三致”作用的全球性重金属污染物。然而，由于其具有特殊的理化性质，加上当前技术水平的限制，汞仍然被广泛应用于工业制造和农业生产，导致水环境汞污染形势严峻，严重威胁水生态健康和鱼类生存。已有研究表明，汞暴露对鱼类有显著的致畸效应，其中脊柱发育异常（或脊柱畸形）是最典型的表现形式。但是，目前的研究大多仅记录了汞暴露诱导鱼类脊柱畸形这一现象，并未对汞暴露下鱼类的脊柱发育情况进行观察分析，更缺乏对其致畸机理的探讨。基于此，本文选用模式动物斑马鱼为研究对象，以氯化汞（HgCl2）提供汞源，首先观察和分析汞暴露下斑马鱼的脊柱发育情况，并结合发育参数和汞富集特征探讨汞暴露对斑马鱼脊柱发育的影响；然后，检测调控脊柱发育过程中软骨细胞和成骨细胞分化的相关物质的含量、酶的活性以及关键基因的表达水平，初步揭示汞暴露损伤斑马鱼脊柱发育的潜在机制。 1.汞暴露对斑马鱼脊柱发育的影响 将斑马鱼胚胎自受精后2h开始分别暴露于Hg2+浓度为0（对照组）、0.4μg/L（低剂量组）、2μg/L（中剂量组）和10μg/L（高剂量组）的水体中至7、14和21dpf，期间统计孵化率、死亡率、畸形率和体长，观察脊柱发育情况并测定脊柱的形态学参数。结果显示，随着水体汞浓度的升高，斑马鱼胚胎的孵化率逐渐降低，并在高剂量组达到显著水平。在7dpf时，高剂量组中斑马鱼体长显著减小、死亡率和畸形率显著升高，而低、中剂量组无显著变化；在14dpf和21dpf时，死亡率仍只在高剂量组显著升高，而畸形率和体长在中、高剂量组中均发生了显著变化。上述结果表明汞暴露损伤了斑马鱼的生长发育，且该损伤随着汞暴露浓度的升高和暴露时间的延长进一步加剧。对21dpf时斑马鱼体内的总汞含量进行检测后发现，随着汞浓度的升高，斑马鱼体内的汞含量逐渐上升，并在中、高剂量组达到显著水平，反映了汞在斑马鱼体内呈现剂量依赖性富集效应。利用茜素红对骨骼进行染色后发现，与对照组相比，中、高剂量组斑马鱼已矿化脊柱的长度明显变短，椎体数量明显减少，并且部分椎体还出现了形态结构异常的现象。通过进一步测量和分析发现，随着汞暴露浓度的升高，脊椎、血管弧和神经弧的长度逐渐减小，椎间盘的长度逐渐增大，并均在中、高剂量组达到显著水平，表明汞暴露抑制脊柱的生长发育以及矿化过程，进而可能导致斑马鱼的脊柱畸形。 2.汞暴露损伤斑马鱼脊柱发育机制的初步研究 为了进一步揭示汞暴露损伤斑马鱼脊柱发育的潜在机制，将斑马鱼胚胎自受精后2h开始分别暴露于Hg2+浓度为0（对照组）、0.4μg/L（低剂量组）、2μg/L（中剂量组）和10μg/L（高剂量组）的水体中至21dpf，检测调控脊柱发育的重要物质含量、酶的活性及关键基因的表达水平。结果显示，汞暴露导致成骨重要物质钙、Ⅰ型胶原蛋白（COL1）和骨钙素（OC）的含量显著下降，碱性磷酸酶（ALP）活性显著增强，表明汞可能干扰了斑马鱼对钙的吸收以及脊柱的矿化；软骨细胞分化与发育相关基因sox9α（中、高剂量组）、col10α1（低、中、高剂量组）和runx2（高剂量组）显著下调，bmp4（高剂量组）显著上调，表明汞可能抑制了软骨细胞的增殖、肥大以及软骨基质的分泌；同时，成骨细胞分化与发育相关基因runx2（高剂量组）、col1a1（低、中、高剂量组）、opn（低、中、高剂量组）和oc（低、中、高剂量组）显著下调，twist1β（高剂量组）显著上调，而alp、bmp2和osx无显著变化，表明汞可能抑制了成骨细胞的早期分化、骨基质的成熟和矿化，但对成骨细胞的定向分化和成熟没有显著影响。 综合以上研究结果，我们推测汞可能通过干扰软骨细胞分化和发育、成骨细胞的早期分化、细胞外基质的成熟与矿化以及斑马鱼体内的钙平衡来抑制斑马鱼脊椎、血管弧和神经弧等脊柱组成元件的生长和发育，进而诱发椎体的畸变，最终导致脊柱的异常发育。

目录

1 绪论

1.1汞的简介和毒性

1.2汞污染现状

1.3汞对鱼类的毒性作用

1.4污染物对鱼类脊柱发育的影响

1.5斑马鱼的脊柱发育

1.5.1 斑马鱼简介

1.5.2 斑马鱼的骨骼发育过程

1.5.3 斑马鱼与哺乳动物骨骼比较

1.6 本研究的目的及意义

2 汞暴露对斑马鱼脊柱发育的影响

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1 实验鱼的饲养及样品采集

2.2.2 实验试剂

2.2.3 实验仪器

2.2.4 总汞测定

2.2.5 茜素红骨骼染色

2.2.6 统计分析

2.3实验结果

2.3.1 孵化率、死亡率、畸形率和体长

2.3.2 汞富集情况

2.3.3 脊柱形态结构

2.3.4 脊柱形态学参数

2.4讨论

2.4.1 汞暴露对斑马鱼仔鱼生长发育的影响

2.4.2 汞暴露对斑马鱼脊柱形态的影响

3 汞暴露损伤斑马鱼脊柱发育机制的初步研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1实验鱼的饲养及样品采集

3.2.2实验试剂

3.2.3实验仪器

3.2.4生化分析

3.2.5基因表达水平分析

3.2.6统计分析

3.3实验结果

3.3.1斑马鱼脊柱发育相关的物质含量及酶活

3.3.2软骨细胞分化及发育相关基因的mRNA表达水平

3.3.3成骨细胞分化及发育相关基因的mRNA表达水平

3.4讨论

3.4.1 汞暴露对调控软骨细胞分化及发育相关基因表达水平的影响

3.4.2 汞暴露对调控成骨细胞分化及发育相关基因表达水平的影响

3.4.3 汞暴露对钙含量的影响

4 结论

参考文献

附录A：作者攻读硕士学位期间发表论文情况

附录B：缩略词表（Abbreviation）

致谢

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