寨卡病毒E蛋白Y158H或V169I突变对乙脑/寨卡嵌合病毒小鼠脑内神经毒力的影响

摘要

目的:探索乙脑/寨卡嵌合病毒JE/ZIKV(Japanese encephalitis/Zika chimeric virus)中寨卡病毒包膜蛋白(Envelope protein,E)第 158 或 169位氨基酸突变(Y158H和V169I)对小鼠脑内神经毒力的影响,探寻控制嵌合病毒小鼠脑内神经毒力的关键氨基酸位点,为寨卡病毒疫苗候选株的安全性评价提供理论基础。方法:以嵌合病毒JE/ZIKV(MR766)全长cDNA质粒为模板,首先运用重叠延伸PCR技术和基因重组技术得到含突变位点的病毒全长cDNA,经测序及酶切鉴定,大量抽提质粒,将大抽质粒Xhol单酶切线性化,以.此为模板体外转录得到嵌合病毒RNA,把RNA电转染导入BHK21细胞拯救得到突变病毒JE/ZIKV(Y158H)和JE/ZIKV(V169I)。通过病毒基因测序、间接免疫荧光实验、生长曲线及蚀斑实验鉴定病毒,并用3周龄昆明小鼠评价突变病毒对小鼠的脑内神经毒力。结果:测序及酶切鉴定证实成功构建JE/ZIKV(Y158H)和JE/ZIKV(V169I)的病毒全长cDNA。蚀斑实验证实转染RNA的细胞培养液上清含有病毒。间接免疫荧光实验表明拯救的两个突变病毒能被抗JEV-NS1抗体识别,不被抗JEV-E抗体识别。病毒测序结果证实成功拯救嵌合病毒并成功引入Y158H或V169I突变位点。蚀斑实验发现:JE/ZIKV蚀斑直径为 1.7±0.2mm,JE/ZIKV(Y158H)蚀斑直径为 1.6±0.1mm,两者之间差异无统计学意义(t=2.46,P=0.09>0.05)。JE/ZIKV蚀斑直径为1.6±0.4mm,JE/ZIKV(V169I)蚀斑直径为1.4±0.4mm,差异无统计学意义(t=0.99,P=0.35>0.05)。生长曲线显示 JE/ZIKV(Y158H)和 JE/ZIKV(V169I)增殖速度均在 60h 达高峰,JE/ZIKV(Y158H)和 JE/ZIKV(V169I)增殖规律相似,但整个病毒增殖过程中JE/ZIKV(Y158H)的增殖效率都略低于原母本病毒JE/ZIKV(MR766),JE/ZIKV(V169I)在前60h和母本病毒一样快速增殖,之后下降幅度比原病毒更大。动物实验结果表明:JE/ZIKV(Y158H)小鼠脑内神经毒力 LD50 为 1964.33 PFU/mL,JE/ZIKV(V169I)小鼠脑内神经毒力LD50为621.33 PFU/mL,而母本病毒JE/ZIKV(MR766)小鼠脑内神经毒力 LD50 为 73.67 PFU/mL。结论:寨卡病毒E蛋白Y158H或V169I突变可以降低JE/ZIKV(MR766)小鼠脑内神经毒力,E158 和 E169 是控制JE/ZIKV(MR766)小鼠脑内神经毒力的两个重要氨基酸位点,其中E158作用更为明显。

目录

摘要

Abstract

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述: 寨卡病毒小鼠脑内神经毒力研究现状

参考文献

附录 英汉缩略语名词一览表

个人简历

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢