昆虫病原真菌金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶分离纯化、特性及其基因克隆的研究

摘要

金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌，在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比，真菌杀虫剂尽管安全，无环境污染，但存在着杀虫速率缓慢的弱点，这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。对昆虫病原真菌致病机制进行研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。海藻糖是一种非还原性二糖，存在于所有已知种类的昆虫中，是昆虫血淋巴中主要的糖类(大约占80-90﹪)；海藻糖在昆虫血液生理中起着重要的作用，其耗竭可能对昆虫起着致命性的作用。虫生真菌侵染进入昆虫血腔后，昆虫血淋巴中的海藻糖成为真菌生长潜在和必需的营养物质。但海藻糖对许多真菌来说是非渗透性二糖，必须在相应的二糖水解酶作用下分解为葡萄糖才能被真菌利用。金龟子绿僵菌侵染进入昆虫血淋巴后，能分泌酸性海藻糖酶，有效地降解昆虫血淋巴中的海藻糖。酸性海藻糖酶在真菌对昆虫的致病过程中起着重要的作用。 目前对真菌酸性海藻糖酶的研究较少，只有少数几个物种中酸性海藻糖酶基因被克隆并测定序列。研究发现酸性海藻糖酶与中性海藻糖酶之间不具同源性，并且不同酸性海藻糖酶基因之间序列同源性很差。这为酸性海藻糖酶的研究增加了难度。在虫生真菌中，还未见酸性海藻糖酶基因克隆方面的报道。本研究以金龟子绿僵菌(M.anisopliae)菌株CQMa102和东亚飞蝗为研究材料，对绿僵菌酸性海藻糖酶培养条件和同工酶进行了系统的研究，并在此基础上采用离子交换、分子筛层析等技术手段分离纯化出绿僵菌酸性海藻糖酶蛋白，对其分子量、等电点以及其它酶学特性进行了详细的研究。在纯化的蛋白氨基酸测序的基础上，通过设计寡核苷酸探针，对构建的绿僵菌基因组文库和随后的亚克隆进行了放射性同位素筛选，结合RACE等技术手段，成功分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因并登录NCBI的GenBank，登录号为：DQ237957(基因组序列)，DQ237958(cDNA序列)。同时对绿僵菌酸性海藻糖酶在真菌侵染过程中的作用进行了较为详细的研究。研究的结果为进一步利用基因工程手段改造病原真菌、提高生物防治效果奠定了基础。主要研究结果如下： 1.利用产物(葡萄糖)测定法，以酶活和同工酶为指标，筛选出适合CQMa102酸性海藻糖酶产酶的培养基和产酶条件如下： 培养基：1.0g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4，1.0g/LKCl，10g/L可溶性淀粉，5g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，pH值调至6.0。把1.0ml1.0-3.0×107个/mlCQMa102孢子悬液接种到100ml上述培养基中，在26℃、150rpm的条件下振荡培养3天，海藻糖水解酶总活性可达到14.125U/L，比活可达到0.4344U/mg。在该培养条件下，绿僵菌产生两种海藻糖降解酶同工酶，其中一个等电点为8.4，而另一个为4.7。 2.经优化的纯化用产酶培养基为：1.0g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4，1.0g/LKCl，2g/L(NH4)2SO4，10g/L可溶性淀粉，10g/LMES，初始pH6.10。每100ml培养液接种3×107孢子。培养液在开放式摇床上150rpm振荡培养72小时，培养温度为26-27℃。 3.通过比较CQMa102菌丝提取液和滤液中海藻糖水解酶的活性，确定了海藻糖水解酶在真菌细胞中的位置。结果表明：CQMa102海藻糖水解酶是分泌性蛋白，主要分泌到培养基中，很少结合在细胞壁上。 4.经过两步阴离子交换层析，一步分子筛层析和一步窄范围等电聚焦分离，得到了纯化的酸性海藻糖酶。该蛋白经SDS-PAGE和等电聚焦电泳(IEF)后，银染，均显示为单一染色条带。该蛋白为糖蛋白，在SDS-PAGE上分子量为170kDa，等电点为4.7。经去糖基化处理后，分子量降为130kDa左右。该酸性海藻糖酶最适pH为5.5，最适反应温度为30℃。其IC50为1.3×10-8M。纯化的绿僵菌酸性海藻糖酶米氏常数(Km)为2.3mM，最高酶促反应速度(Vmax)为0.412mmolmin-1×mgprotein-1(以海藻糖为底物)。该纯化的酶在40℃孵育4小时，活性没有变化；在50℃条件下，随孵育时间延长，酶活性线形降低；当孵育温度超过60℃，酶迅速失去活性。该海藻糖酶具有很高的底物专一性，在测试的8种二糖中，只对海藻糖有催化活性。Trehazolin，一种海藻糖酶特异性抑制剂，能有效地抑制该酶活性。 5.Edman降解法测定酸性海藻糖酶前15个氨基酸序列为：RDRVAKYKARYSGSG。酸性海藻糖酶蛋白nano-ESI-MS/MS分析，获得6段多肽片断氨基酸序列，分别为：YSGSGLDWN；DSDVKSVWHR；NAASSALSQGFYK；GDVAGLPFLQVDK；PHTLLLTGDLLAGQR；WVQASGDAFDDPKQVAK。 6.成功构建了绿僵菌基因组DNA文库，文库插入片段大小平均为40kb。 7.根据肽段：WVQASGDAFDDPKQVAK设计寡核苷酸猜测子探针：5’TGGGTCCAGGCCTCTGGTGATGCCTTTGATGACCCTAAGCAGGTTGCCAAG3’，以该探针对绿僵菌DNA文库和随后的亚克隆进行放射性同位素筛选，结合RACE等技术手段分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因，其GenBank登录号分别为DQ237957(DNA序列)和DQ237958(cDNA序列)。酸性海藻糖酶基因含有2个内含子，其开放阅读框(ORF)编码一个含1073个氨基酸的蛋白质，该酸性海藻糖酶具有一个20个氨基酸的信号肽序列和含有30个可能的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr)。NCBI序列比对(Blastn)显示该蛋白与Aspergillusfunigatux的alpha,alphatrehaloseglucohydrolase，Aspergillusnidalans的酸性海藻糖酶前体和Talaromycesemrsonii的酸性海藻糖酶分别有62﹪、59﹪和57﹪的氨基酸相似性；同时与另外两个真菌Saccharomycescerevisiae(Ath1p)和Candidaalbicans(Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有约25﹪的氨基酸同源性。将该酸性海藻糖酶基因命名为ATM1，即foracidtrehalaseofMetarhiziumanisopliae，相应蛋白为Atmp1。 8.东亚飞蝗感染绿僵菌后，血淋巴中海藻糖含量急剧下降，但是葡萄糖含量并未上升，反而与对照相比有所降低。对感染后蝗虫血淋巴进行海藻糖酶同工酶分析(5﹪窄范围等电聚焦电泳)发现感染血淋巴中新出现一条同工酶带，该条带与纯化出的酸性海藻糖酶具有相同的等电点和底物特异性。同时，离体实验也表明纯化的酸性海藻糖酶能够有效降解血淋巴中海藻糖为葡萄糖。 9.RT-PCR实验结果表明，当绿僵菌侵染进入东亚飞蝗血淋巴后，ATM1基因能够有效地进行表达，因此在感染后东亚飞蝗血淋巴中新出现的酸性海藻糖酶应该就是ATM1基因表达的产物。

目录

文摘

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1 绪论

1.1引言

1.2.研究背景

1.2.1昆虫病原真菌防治害虫简史

1.2.2病原真菌侵染寄生昆虫的过程

1.2.3虫生真菌侵染致病机理

1.2.4寄主的抵御作用

1.3立题依据

1.4本研究的目标和内容

1.5整体设计思路

1.6创新之处

2 金龟子绿僵菌海藻糖降解酶诱导培养条件的优化

2.1技术路线

2.2材料与方法

2.2.1供试菌株

2.2.2主要仪器

2.2.3主要试剂

2.2.4培养基

2.2.5供试菌株培养及分生孢子悬浮液制备

2.2.6CQMal02产海藻糖降解酶培养条件研究

2.2.7粗酶液提取

2.2.8海藻糖降解酶活性测定

2.2.9蛋白质浓度测定

2.2.10CQMal02海藻糖降解酶的定位

2.2.11CQMal02海藻糖降解酶同工酶分析

2.3结果与分析

2.3.1不同碳源对绿僵菌产生海藻糖降解酶的影响

2.3.2不同碳源对绿僵菌海藻糖降解酶同工酶的影响

2.3.3不同氮源对绿僵菌产生海藻糖降解的影响

2.3.4不同氮源对绿僵菌海藻糖降解酶同工酶的影响

2.3.5不同初始pH对绿僵菌产生海藻糖降解酶的影响

2.3.6不同接种量对绿僵菌产生海藻糖降解酶的影响

2.3.7CQMal02菌丝提取液和滤液中海藻糖降解酶活性比较

2.3.8绿僵菌CQMal02海藻糖降解酶最佳诱导培养条件的确定

3 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶蛋白分离纯化及其特性分析

3.1技术路线

3.2材料和方法

3.2.1主要仪器设备

3.2.2主要化学试试剂

3.2.3部分储液配方

3.2.4供试菌株

3.2.5产酶培养条件

3.2.6分离纯化

3.2.7酶活检测

3.2.8蛋白质浓度测定

3.2.9SDS-PAGE测定蛋白质分子量

3.2.10纯化的蛋白去糖基化

3.2.11酸性海藻糖酶的性质测定

3.2.12N-端氨基酸序列测定

3.2.13纳升电喷雾质谱(nano-ESI-MS/MS)肽片段序列测定

3.3结果与分析

3.3.1海藻糖降解酶同工酶分析

3.3.2酸性海藻糖酶蛋白的分离纯化

3.3.3酸性海藻糖酶去糖基化

3.3.4酸性海藻糖酶蛋白的酶学特性

3.3.5酸性海藻糖酶蛋白N-末端氨基酸序列分析

3.3.6酸性海藻蛋白nano-ESI-MS/MS分析

4 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因(ATM1)的克隆及分析

4.1技术路线

4.2材料与方法

4.2.1主要仪器设备

4.2.2主要试剂

4.2.3培养基及部分储液配方

4.2.4试验菌株与质粒

4.2.5总DNA的提取

4.2.6基因组DNA文库构建

4.2.7酸性海藻糖酶基因(ATM1)的文库筛选

4.2.8寡核苷酸猜测子控针的设计

4.2.9文库亚克隆及其筛选

4.2.10DNA序列分析

4.2.11mRNA编码序列分析

4.3结果与分析

4.3.1金龟子绿僵菌CQMal02总DNA提取

4.3.2金龟子绿僵菌基因组文库的构建及其质量评估

4.3.3ATM1基因寡核苷酸猜测子探针的设计

4.3.4ATM1基因的文库阳性菌落筛选

4.3.5ATM1基因文库亚克隆及其筛选

4.3.6亚克隆片段DNA序列分析验证

4.3.7ATM1基因DNA全序列分析

4.3.8ATM1基因3’cDNA序列克隆

4.3.9ATM1基因序列分析

4.3.10ATM1基因氨基酸序列分析

5 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶在真菌侵染过程中的作用分析

5.1技术路线

5.2材料与方法

5.2.1金龟子绿僵菌及东亚飞蝗

5.2.2主要仪器设备

5.2.3主要试剂

5.2.4东亚飞蝗绿僵菌感染试验

5.2.5东亚飞蝗血淋巴收集及处理

5.2.6东亚飞蝗血淋巴海藻糖降解酶活性的测定

5.2.7东亚飞蝗血淋巴海藻糖和葡萄糖含量的测定

5.2.8纯化的金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶降解东亚飞蝗血淋巴中海藻糖能力的离体测定

5.2.9等电聚焦电泳与凝胶酶染显色分析

5.2.10RT-PCR检测

5.3结果与分析

5.3.1CQMal02侵染对东亚飞蝗血淋巴中海藻糖含量影响的结果

5.3.2CQMal02侵染对东亚飞蝗血淋巴中葡萄糖含量的影响

5.3.3金龟子绿僵菌CQMal02感染东亚飞蝗对血淋巴中海藻糖水解酶活性的影响

5.3.4金龟子绿僵菌CQMal02感染东亚飞蝗对血淋巴中海藻糖水解酶同工酶影响

5.3.5纯化的金龟子绿僵菌酸性海藻酶对东亚飞蝗血淋巴中海藻糖降解能力的离体测定`

5.3.6RT-PCR检测金龟子绿僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因(ATM1)在浸染东亚飞蝗血淋巴中的表达

6 讨论

6.1绿僵菌酸性海藻糖酶诱导培养条件的优化

6.2绿僵菌酸性海藻糖酶的定位

6.3金龟子酸性海藻糖酶分离纯化及纯化中存在的问题

6.4金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶学特性分析

6.5金龟子绿僵菌酸性海藻酶末端氨基酸序理分的和多肽片断MS/MS序列分析

6.6酸性海藻糖酶基因克隆策略

6.7基因组文库及亚克隆放射性同位素筛选策略

6.8金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因结构分析

6.9酸性海藻糖酶在绿僵菌侵染中的生物学功能分析

7 结论及展望

致谢

参考文献

附录作者在攻读博士学位期间发表或拟发表的论文目录