淋巴增强因子-1(Lef-1)在毛囊Bulge干细胞分化中可能作用的初步研究

摘要

毛囊是皮肤的基本结构单位之一,它依赖于自身的干细胞通过毛发的生长期、退化期和静止期的不断更替来维持其自我更新。毛囊干细胞是一种重要的成体干细胞,由于其自身的周期变化使其成为进行成体干细胞增殖、分化研究的良好模型。
　　除具有很强的自我更新能力外,毛囊干细胞另一个引人注目的特性是具有很强的多向分化的潜能,能够分化成为毛发、表皮及皮脂腺等。然而,体内正常情况下毛囊干细胞首先向毛发谱系定向分化,只有在表皮或皮脂腺受到损伤时,它们才进行程序重组而向表皮或皮脂腺方向分化。1990年,Cosarelis等提出毛囊的“隆突激活假说”,认为来源于毛乳头的信号因子触发了毛囊干细胞向下迁移并分化,从而维持了毛发周期的正常循环。近年来,大量的实验证据支持了这一观点,使其得到研究者广泛的认同。
　　毛乳头诱导毛囊干细胞分化的过程中涉及众多信号分子,Wnt/Lef-1信号通路就是此过程中极其重要的一条信号途径。大量研究显示Lef-1基因敲除小鼠触须毛囊完全消失,背皮毛囊生长停止;而Lef-1过表达时在上皮中出现大量新生的毛囊,而且随着时间的推移,最终导致皮肤肿瘤的出现。因此,Lef-1因子在毛囊的发育和生长的过程中起到重要的调节作用。
　　那么Lef-1是否影响毛囊Bulge干细胞体外诱导分化以及在此过程中它又是怎样发挥其功能?目前,对这些问题的认识尚浅。
　　本课题采用免疫组织化学(IHC)和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,初步探索Lef-1在触须毛囊生长周期中的变化及可能的作用;分别利用Transwell体系及毛乳头细胞诱导培养液模拟体内情况下毛囊Bulge干细胞的定向分化,并采用免疫细胞化学(IHC)和逆转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)技术研究Lef-1在此过程中可能发挥的作用;利用基因转染技术初步研究在外条件下Lef-1基因及β-catenin结合位点突变的NLef-1基因转染对毛囊Bulge干细胞性状的影响,主要结果如下:
　　①检测了Lef-1蛋白在毛发周期中的表达规律。生长期初期,Lef-1在毛球部的毛母质中表达强烈,呈现明显的核表达,沿ORS向上表达逐渐减弱,随着生长的推进,核表达逐渐转化为胞浆表达;在退化期,Lef-1表达明显减弱；当毛囊进入静止期,Lef-1在bulge区以下的IRS中表达明显增强。
　　②利用Transwell体系及毛乳头细胞诱导培养液模拟体内情况下毛囊干细胞的定向分化,结果显示毛发特异性标志物K6表达明显增强,且Transwell体系诱导效果略高于乳头细胞诱导培养液。
　　③在体外诱导情况下,Lef-1及其上游辅因子β-catenin和下游分化基因c-Myc的表达呈一致性,均明显增强,且Lef-1较β-catenin先进入核内。
　　④瞬时转染后Lef-1基因引起β-catenin的易位入核,且开启了毛囊Bulge干细胞向毛发方向的分化;而NLef-1基因对β-catenin的易位入核及毛囊Bulge干细胞向毛发方向的分化影响较小。
　　综上所述,本课题表明,Lef-1在毛囊Bulge干细胞的定向分化中发挥及其重要的作用:它能够促进β-catenin的易位入核,调节下游分化基因的表达,最终引起毛囊Bulge干细胞向毛发方向的分化。

目录

中文摘要

英文摘要

1 绪论

1.1 研究背景及国内外研究现状

1.2 研究意义

2 Lef-1在大鼠触须毛囊周期中的表达

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验动物

2.2.2 主要实验设备

2.2.3 主要药品和试剂

2.2.4 主要试剂的配制

2.2.5 实验方法

2.3 结果

2.3.1 Lef-1在大鼠触须毛发周期中的表达

2.3.2 RT-PCR检测Lef-1 mRNA在触须毛发周期中的表达

2.4 讨论

3 毛囊Bulge区细胞的培养及鉴定

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验动物

3.2.2 主要实验设备

3.2.3 主要药品和试剂

3.2.4 主要试剂的配制

3.2.5 实验方法

3.3 结果

3.3.1 免疫组织化学检测β1.integrin、CD34两个干细胞标记分子在毛囊中的表达

3.3.2 毛囊Bulge干细胞的原代培养

3.3.3 毛囊Bulge区细胞的生长状况

3.3.4 免疫细胞化学检测干细胞特异性标志物β1.integrin、CD34、α6.integrin及分化标志物K10在毛囊Bulge干细胞的表达

3.3.5 免疫细胞化学检测特异性增殖标志物Ki67

3.4 讨论

4 毛囊Bulge干细胞体外诱导微环境的建立

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验动物

4.2.2 主要实验设备

4.2.3 主要药品和试剂

4.2.4 主要试剂的配制

4.2.5 实验方法

4.3 结果

4.3.1 毛乳头细胞的培养及鉴定

4.3.2 诱导分化结果的鉴定

4.4 讨论

5 Lef-1在毛囊Bulge干细胞诱导分化中可能作用的初步研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 主要实验设备

5.2.2 主要药品和试剂

5.2.3 主要试剂的配制

5.2.4 实验方法

5.3 结果

5.3.1 免疫细胞化学鉴定诱导前后Lef-1及相关因子在毛囊Bulge干细胞中的表达

5.3.2 RT-PCR检测诱导前后Lef-1的表达

5.4 讨论

6 Lef-1基因及N端突变Lef-1基因对毛囊Bulge干细胞影响的初步研究

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 主要实验设备

6.2.2 主要药品和试剂

6.2.3 主要试剂的配制

6.2.4 实验方法

6.3 结果

6.3.1 大鼠Lef-1基因全长及N端截短基因的获得

6.3.2 Lef-1.GFP及NLef-1.GFP质粒的获得

6.3.3 测序结果

6.3.4 Lef-1基因转染后β-catenin在毛囊Bulge干细胞中的表达

6.3.5 Lef-1基因转染后毛发分化标志物k6在毛囊Bulge干细胞中的表达

6.4 讨论

7 结论与展望

7.1 全文总结

7.2 展望

致谢

参考文献

附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录