根癌农杆菌介导番茄抗病基因Tm-2转化马铃薯的研究

摘要

马铃薯是世界上产量仅次于小麦、玉米和水稻的第四大粮食作物，其单位面积单位时间的产量高于前三种作物。马铃薯粮菜兼用，营养丰富，联合国充分肯定了马铃薯在确保世界粮食安全和消除贫困中起的重大作用，并确定2008年为“国际马铃薯年”。但病毒侵染一直是导致马铃薯品种退化的主要因素，严重影响马铃薯的产量和品质。传统的育种方式已经不能满足马铃薯生产的需要，不能从根本上长期解决马铃薯病毒害问题。近年来，随着基因工程的迅速发展和转基因技术体系的日益完善，基因工程技术在提高马铃薯抗病性方面(尤其是抗病毒)显示了极大的潜力，必将成为马铃薯抗病毒育种的主要手段。
　　 本文研究是根据已知番茄抗病基因Tm-22抗病机理及其功能，以及番茄抗病基因Tm-22转化茄科植物烟草并对侵害茄科植物的病毒(如TMV、ToMV等)具高抗特性的报道，利用番茄与马铃薯亲缘关系较近特点，采用基因工程技术将Tm-22基因转入马铃薯，筛选、鉴定已表达Tm-22基因的转基因马铃薯，分析其对危害马铃薯常见病毒的抗性。实验所取得的主要结果如下：
　　 1、根据己报道的番茄抗性基因Tm-22设计特异性引物通过RT-PCR扩增得到2段部分Tm-22基因片段，再通过酶切和连接得到全长Tm-22基因序列，经比对证实KBV为含Tm-22基因的番茄品系。进一步证实番茄品系KBV对侵染茄科作物的病毒TMV、ToMV有很高的抗性是Tm-22基因表达所赋予的。
　　 2、利用CaMV35S启动子和Tm-22基因的DNA全长序列，构建出番茄Tm-22基因用于超表达的双元载体pBIN19-Tm-22，再将该表达载体转化到根癌农杆菌LB4404中。
　　 3、对己报道的试管薯诱导技术进行简单的改进，即转接入诱导培养基的马铃薯组织不经过光照培养直接进行黑暗处理，能在较短的时间里诱导出试管薯。
　　 4、以诱导出来的试管薯切片做转化受体，将含双元载体pBIN19-Tm-22的根癌农杆菌工程菌对其侵染转化，在含有75mg.L-1卡那霉素的选择培养基上，2-3周可产生抗性芽，4-5周获得完整的转基因植株。最后生根筛选得到能够生根的抗性植株，且PCR检测结果为阳性，抗性株含超表达载体上特有的NPTⅡ基因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1 绪 论

1.1引言

1.2转基因技术在马铃薯抗病毒育种中的应用

1.2.1 RNA介导的抗病毒基因工程

1.2.2蛋白质介导的抗病毒基因工程

1.2.3马铃薯抗病毒基因工程研究的特点、存在问题以及发展趋势

1.3番茄抗病毒基因Tm-22研究进展

1.3.1 Tm-22基因及其Tm基因家族简介

1.3.2 Tm-22基因的抗性机理

1.3.3目前Tm-22基因在茄科植物抗病毒中的应用

1.4本课题研究的目的、意义与内容

1.4.1研究目的及意义

1.4.2研究内容

2通过克隆、拼接获得全长Tm-22基因序列

2.1材料与试剂

2.1.1植物材料、质粒、菌株、试剂

2.1.2主要仪器设备

2.1.3常用试剂配制

2.2实验方法

2.2.1番茄叶片总RNA提取

2.2.2番茄叶片基因组DNA提取

2.2.3核酸质量及浓度测定

2.3番茄Tm-22基因部分片段的克隆

2.3.1引物设计

2.3.2 RT-PCR

2.4通过酶切和拼接得到全长Tm-22基因序列

2.4.1质粒DNA的酶切

2.4.2互补粘性末端的连接

2.5结果与分析

2.6讨论

3用于超表达的双元载体pBIN19-Tm-22的构建

3.1材料与试剂

3.1.1植物材料、质粒、菌株

3.1.2主要仪器设备

3.1.3主要化学试剂和试剂盒

3.1.4实验所用试剂的配制

3.2实验方法

3.2.1质粒DNA的制备

3.2.2质粒的酶切及连接

3.2.3双元载体的构建

3.3结果与分析

3.4讨论

4试管薯的诱导及根癌农杆菌介导转化

4.1材料与试剂

4.1.1植物材料、质粒、菌株

4.1.2主要仪器设备

4.1.3主要化学试剂和试剂盒

4.1.4实验所用试剂的配制

4.2试验方法

4.2.1诱导试管薯

4.2.2农杆菌介导的试管薯转化

4.2.3 PCR检测筛选得到的抗性植株

4.3结果分析

4.4讨论

5结论与展望

5.1主要结论

5.2后续研究工作的展望

致 谢

参考文献

附 录