昆虫肠道芽孢杆菌的绿色荧光蛋白标记及其表达特性研究

摘要

芽孢杆菌是很有应用潜力的蛋白表达宿主菌，可以用于蛋白表达系统的研究，生防细菌的构建等方面。构建带有苏云金芽孢杆菌 cry3a基因非芽孢依赖型启动子和绿色荧光蛋白基因 gfp（Green Fluorescent Protein）的原核表达载体，并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌：短短芽孢杆菌 CQUBb和苏云金芽孢杆菌 CQUBt，以检测 cry3a 启动子 pro3a在昆虫肠道常驻菌中的启动转录活性，获得 GFP 标记菌株，为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况研究和杀虫工程菌的构建奠定基础。采用重叠延伸 PCR 将 cry3a基因启动子和 gfp基因进行融合，并与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体 pHT304连接构建重组质粒 pHT3AG，获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌 CQUBb和苏云金芽孢杆菌 CQUBt，在可见光和荧光显微镜下观察荧光表型并通过 SDS-PAGE 分析重组菌株的蛋白表达情况，然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。该部分研究获得以下主要结果：
　　 采用重叠延伸 PCR 将 cry3a基因启动子和 gfp基因进行融合，并与 pHT304 载体连接，成功获得重组质粒 pHT3AG。获得的重组质粒以电脉冲并转化进入肠道常驻菌短短芽孢杆菌 CQUBb和苏云金芽孢杆菌 CQUBt，获得重组工程菌 CQUBb-pHT3AG和 CQUBt-pHT3AG。工程菌于可见光和荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光。经液体培养，重组菌在营养期大量组成型表达 GFP，经电泳分离在凝胶上出现约29 kDa的特异蛋白条带-绿色荧光蛋白，表明 cry3a基因核心启动子和 gfp基因已成功地转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌，并且cry3a基因得核心启动子 pro3a 可以在非 Bt菌株中发挥作用。将重组菌与出发菌株在同样条件下培养，重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异，说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响。两个菌株比较，CQUBb 比 CQUBt 质粒转化率高、重组菌 GFP 表达时间长、表达量大，并且重组菌株稳定性好，可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。
　　 获得了高效表达外源蛋白的重组菌株 CQUBb-pHT3AG 后，通过传代培养的方法研究工程菌株的稳定性，研究含有外源蛋白可溶性表达载体的工程菌株CQUBb-pHT3AG的稳定性及菌种保藏时的最佳条件，并以实时荧光定量 PCR 方法检测工程菌株传代中各代质粒拷贝数的变化。结果显示，在没有筛选压力下工程菌株存在不稳定性，传代至 100 次时的质粒保有率只有 40％；适当的筛选压力（培养时添加抗生素）可以显著降低质粒的遗传不稳定性，100 代时重组质粒保有率可以提高到 55％。传至各代的工程菌株在菌落形态、菌体形态、生长动力学特性、外源基因序列等方面均未见明显差异。稳定性分析显示重组芽孢杆菌具有一定的遗传不稳定性，这种不稳定包括质粒的完全丢失及部分丢失。适当增加抗性压力可以增加其稳定性。传代 40 次以内的菌株稳定性较好，可以用作蛋白表达系统建立等方面的研究。
　　 实时荧光定量 PCR 经常被用作质粒或其他基因的拷贝数分析。本研究建立了利用相对实时荧光定量 PCR方法对各代的质粒拷贝数进行测定的方法。结果表明，实时荧光 PCR 是一种快速、方便、低成本的外源质粒稳定性的分析方法。以此种方法分析显示，工程菌传代过程中在没有抗性压力的情况下，随传代次数增加，工程菌株中重组质粒拷贝数有明显的下降趋势；培养时增加抗生素胁迫时这种下降趋势稍缓和。SDS-PAGE 分析也显示出随传代次数增加，蛋白表达量有减少趋势，即蛋白表达量同质粒拷贝数具有正相关性。
　　 定量 PCR 过程中为了避免本研究在 DNA 提取过程中出现较大误差，我们将发酵液超声波破碎后加热处理，并于-20℃储存，将其作为实施荧光定量 PCR的模板。在实施荧光定量 PCR 中，我们考虑了因为染色体 DNA的扩增和质粒 DNA的扩增效率不同对实验结果的影响。我们在同一次的反应过程中，分别确定两者的扩增效率，分别计算，克服了假设去扩增效率一直带来的误差。这种快速检测方法，我们用之来检测重组芽孢杆菌的质粒拷贝数，分析了在有抗性压力和没有抗性压力的情况下，发酵时或传代时外源质粒的拷贝数变化。经检测，随着传代次数的增加，质粒的拷贝数呈现急剧的减少，在有选择压力的情况下，质粒的稳定性要好于没有选择压力时的稳定性。在我们的研究中，应用个整细胞作为模板，并且考虑待测基因和内参基因的扩增效率差异大大的提升了次方法对工程菌株质粒拷贝数的检测准确性。
　　 研究还探讨了工程菌株的贮存条件和耐储性。液体保藏菌株时在保藏条件为 20％或 30％的甘油水溶液中，经-40℃贮存 12个月后仍具有良好的复苏性能（高于 50％）。稳定性分析显示重组芽孢杆菌具有一定的遗传不稳定性，这种不稳定包括质粒的完全丢失及部分丢失。适当增加抗性压力可以增加其稳定性。传代40 次以内的菌株稳定性较好，可以用作蛋白表达系统建立等方面的研究。

目录

文摘

英文文摘

1 绪 论

2 GFP 表达载体的构建及其在昆虫肠道常驻菌中的表达

3 工程菌CQUBb-pHT3AG的遗传稳定性分析

4 实时荧光定量 PCR 检测工程菌株外源质粒拷贝数

5 讨 论

6 结论与展望

致 谢

参考文献

附 录