Construction of Bacillus thuringiensis wild-type S76 and Cry- derivatives expressing a green fluorescent protein: two potential marker organisms to study bacteria-plant interactions

摘要

Collectively, the species Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, and Bacillus anthracis represent microorganisms of high economic, medical, and biodefense importance. Although the genetic correlation and pathogenic characteristics have been extensively dissected, the ecological properties of these three species in their natural environments remain poorly understood. Thus, a tractable marker for detecting these bacteria under specific environmental and physiological conditions is a valuable tool. With this purpose, a plasmid (pAD43-25) carrying a functional gfp gene sequence (gfpmut3A) was introduced into the wild-type strain Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki S76, which bears approximately 11 plasmids, allowing constitutive synthesis of green fluorescent protein (GFP) during vegetative growth (strain S76GFP+). Additionally, this vector was transferred to a plasmid-cured (Cry-) B. thuringiensis host. Bright green cells were detected by fluorescence microscopy in both recombinants by 2 h after inoculation in liquid medium and could be seen throughout the remaining cultivation time until complete sporulation was accomplished. For strain S76GFP+ protein profile and plasmid DNA analyses indicate, respectively, that this recombinant maintained Cry proteins expression and resident plasmid outline. Thus, in addition to the potential of strain S76GFP+ as a marker organism in bacteria-plant interaction studies, the production and stability of active GFPmut3a make this unique expression system a useful experimental model to study adaptive changes of host-plasmid as well as plasmid-plasmid relationships in a population of cells stressed by the production of a recombinant protein.%Collectivement, les espèces Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus et Bacillus anthracis constituent des microorganismes de grande importance d'un point de vue économique, médical et pour le contrôle biologique. Même si la corrélation génétique et les caractéristiques pathogènes de ces trois espèces ont été beaucoup étudiées, leurs propriétés écologiques dans leurs environnements naturels demeurent peu comprises. Ainsi, l'existence d'un marqueur facile d'emploi pour détecter ces bactéries sous des conditions environnementales et physiologiques spécifiques serait un outil précieux. À cette fin, un plasmide (pAD43-25) comportant une séquence gfp fonctionnelle (gfpmut3A) a été introduit dans la souche sauvage Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki S76, qui contient environ onze plasmides, résultant en une synthèse constitutive de la protéine flourecente verte (GFP) lors le la croissance végétative (souche S76GFP+). De plus, ce vecteur a été transféré chez un hôte B. thuriengiensis ayant subi une cure plasmidique (Cry-). Des cellules vertes brillantes ont été détectées en microscopie à fluorescence chez les deux types de recombinants environ 2 h après une inoculation en milieu liquide et elles ont pu être observées durant toute la période de culture, jusqu'à ce que la sporulation soit complétée. Le profil d'expression protéique et les analyses de l'ADN des plasmides de la souche S76GFP+ indiquent que chez ce recombinant, l'expression des protéines Cry et les plasmides résidents sont respectivement maintenus. Ainsi, en plus du potentiel d'utilisation de la souche S76GFP+ comme marqueur lors d'études d'interactions bactérie-plante, la production et la stabilité du GFPmut3a actif fait de ce système d'expression unique un modèle expérimental utile à l'étude de changements adaptatifs des relations hôte-plasmide et plasmide-plasmide chez les populations de cellules stressées par la production d'une protéine recombinante.