球孢白僵菌中疏水蛋白基因功能的研究

摘要

真菌和昆虫的相互作用在维持生态系统平衡,保持生物多样性和在病原菌的进化方面起重要作用。昆虫病原真菌是自然界控制有害昆虫群体数量的主要因素之一,由真菌致病死亡的昆虫约占全部病原微生物致病死亡的60％。昆虫病原真菌是自然界中唯一能直接穿透寄主体壁致病的病原微生物,其致病机制比病原细菌、病毒更为复杂。昆虫病原真菌.球孢白僵菌(Beauveria bassiana),既可以腐生和作为植物内生菌的形式生活,也可以感染和寄生昆虫和其他节肢动物。虽然白僵菌(B.bassiana)可以根据不同的外界环境产生不同形态的孢子,例如分生孢子、芽生孢子、微循环孢子以及在昆虫体内产生虫菌体,但是它主要靠分生孢子侵染寄主昆虫。分生孢子成功吸附到昆虫表皮是致病过程中第一步也是非常关键的过程。在昆虫病原真菌金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)中已经克隆了两个跟真菌附着相关的基因,一个在孢子与昆虫之间的附着密切相关,另外一个在孢子与植物之间的附着发挥重要的作用,但是在白僵菌(B.bassiana)中没有发现相关的蛋白。
　　 疏水蛋白是一类在真菌中分布广泛,功能多样的蛋白,在包括致病等许多重要的过程中发挥着重要的作用。尽管有些学者认为由疏水蛋白介导的疏水性作用力在介导真菌和昆虫之间的吸附中起重要作用,但是目前仍然缺少直接的证据。本论文以国内外应用广泛的球孢白僵菌(B.bassiana)为研究材料,在获得两个疏水蛋白基因的基础上应用基因敲除技术结合扫描电镜、原子力显微镜和免疫荧光技术分析其在真菌生长、发育和致病机理中的功能。
　　 主要研究成果如下:
　　 ①球孢白僵菌(B.bassiana)高效稳定遗传转化标记的筛选成功的将稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)磺酰脲(sulfonylurea)的抗性基因sur(acetolactate synthase gene)转入到球孢白僵菌(B.bassiana)中。转化效率达到了100-150转化子/μg DNA。以sur基因为筛选标记,构建了pSUR-eGFP载体,该载体含有egfp的表达原件,得到的重组菌株既具有磺酰脲的抗性,又能观察到较强的荧光,并且转化子的遗传稳定。
　　 ②转化方法的优化通过调节选择培养基的pH达到了提高转化效率的目的。以pSUR-eGFP为载体,转化效率由未调节之前的40个转化子/μg DNA(pH7.5)达到了调节后的150个转化子/μg DNA(pH6.5)。改进后的转化效率显著高于球孢白僵菌(B.bassiana)的其它转化方法(5-50个转化子/μg DNA)。另外,感受态细胞制备以后,至少可以稳定保存3个月不影响转化效率,接下来的转化步骤与酵母的转化很相似,只需1 h就可以完成,大大简便了球孢白僵菌(B.bassiana)的遗传转化。
　　 ③hyd1和hyd2侧翼序列的克隆利用YADE(Y shape adaptor dependent extension)技术,根据已知的序列设计引物,分别对hyd1和hyd2的上、下游序列进行延伸,得到包括启动子序列和完整的开放阅读框的片段4.3 kb(hyd1)和2.9 kb(hyd2),GenBank登录号分别为EF452344和EF520285。
　　 ④疏水蛋白基因功能研究a.蛋白定位免疫荧光分析表明,Hyd1分布在分生孢子和微循环孢子的表面,在芽生孢子中没有检测到表达。在萌发的孢子中,只在孢子基座中检测到nyd1,在新萌发的芽管中没有检测到表达。与Hyd1相比,Hyd2的信号比较弱,只分布在分生孢子表面,在微循环孢子和芽生孢子中没有检测到表达。与Hyd1相似,Hyd2在萌发的孢子中只分布在孢子基座中,在芽管中没有检测到表达。另外,在虫菌体中没有检测到Hyd1和Hyd2。
　　 b.疏水蛋白在形成孢子外壁中的模型根据扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)和原子力显微镜(atomicforce electron microscope.AFM)对孢子表面的观察结果,比较了野生型菌株和各突变体孢子表面特征的差异,得到nyd1和Hyd2在球孢白僵菌(B.bassiana)孢子外壁形成中的模型。Hyd1负责形成孢子表面的“突起”(fascicle bundles),同时它起到“边界蛋白”/“伴侣蛋白”的功能,使Hyd2形成有序的结构。Hyd2形成“突起”(fascicle bundles)上的“条纹状”(Rodlets)的结构。二者有序的排列在一起共同组成分生孢子表面结构。
　　 c.疏水蛋白在球孢白僵菌(B.bassiana)发育中的作用孢子疏水性测试(microbial adhesion to hydrocarbons,MATH)表明,hyd1和hyd2都赋予分生孢子疏水性,hyd1和hyd2同时缺失将会使孢子的疏水性进一步下降。△hvd1的孢子在溶液中很难分散,容易形成块状结构,△hyd2的孢子对疏水性底物的吸附能力大大降低。hyd1和hyd2的缺失不会影响球孢白僵菌(B.bassiana)在PDA和SDB培养基上的萌发,不会影响菌株对KC1、calcofluor white、山梨醇、SDS和干果红等的抗逆性。
　　 d.疏水蛋白缺失影响细胞壁碳水化合物的种类和分布生物凝集素和β-1,3葡聚糖抗体标记显示相比野生型菌株,△hyd1和△hyd1△hyd2对所测试的凝集素和β-1,3葡聚糖抗体的结合能力提高了2-4倍,△hyd2的结合能力与野生型菌株差异不显著。
　　 e.疏水蛋白的缺失影响球孢白僵菌(B.bassiana)的毒力毒力测试表明,体壁侵染时相比野生型菌株,疏水蛋白突变菌株对大蜡螟(Galleria mellonella)的毒力降低,直接注射血淋巴时,突变菌株的毒力没有降低。因此,影响球孢白僵菌(B.bassiana)的侵染效率发生在体表入侵阶段。可能通过影响孢子对昆虫体壁的吸附和孢子在昆虫体壁的萌发实现。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 研究背景

1.1.1 生物农药在有害生物的防治中的作用

1.1.2 昆虫病原真菌侵染寄主的致病机理研究进展

1.1.3 昆虫病原真菌工程菌的研究进展

1.1.4 疏水蛋白研究进展

1.1.5 昆虫病原真菌遗传转化的研究进展

1.2 研究内容和意义

1.3 技术路线

1.4 本研究的创新性

2 球孢白僵菌高效稳定遗传转化标记的筛选

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 载体

2.1.3 培养基

2.1.4 生物化学试剂

2.1.5 主要仪器设备

2.1.6 主要缓冲液配方

2.1.7 供试昆虫

2.2 方法

2.2.1 菌株培养及分生孢子悬浮液制备

2.2.2 真菌DNA小量提取

2.2.3 真菌DNA大量提取

2.2.4 遗传转化标记的筛选

2.2.5 基于sur筛选标记的真菌表达载体pSUR-eGFP的构建

2.2.6 球孢白僵菌芽生孢子感受态细胞制备和转化

2.2.7 培养基pH对转化效率的影响

2.2.8 不同保存时间对感受态转化效率的影响

2.2.9 转化子的PCR分析

2.2.10转化子的Southern杂交分析

2.2.11转化子的遗传稳定性分析

2.3 结果与分析

2.3.1 遗传转化标记的筛选

2.3.2 pH对转化效率的影响

2.3.3 转化子的分子验证

2.3.4 保存时间对转化效率的影响

2.4 讨论

2.5 小结

3 疏水蛋白基因的克隆与功能分析

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 载体

3.1.3 主要培养基配方

3.1.4 主要化学试剂

3.1.5 主要仪器设备

3.1.6 主要缓冲液配方

3.1.7 供试昆虫

3.2 方法

3.2.1 分生孢子

3.2.2 芽生孢子(Blastospore)

3.2.3 微循环孢子(Submerged conidia)

3.2.4 虫菌体的制备

3.2.5 真菌DNA提取

3.2.6 真菌RNA的提取

3.2.7 真菌感受态细胞制备和转化

3.2.8 疏水蛋白基因hyd1和hyd2侧翼序列的克隆

3.2.9 hyd1和hyd2敲除载体的构建

3.2.10双敲除载体的构建

3.2.11互补载体的构建

3.2.12hyd1和hyd2融合表达标签载体的构建

3.2.13hyd1和hyd2敲除突变体转化子的筛选

3.2.14hyd1和hyd2互补菌株的筛选

3.2.15hyd1和hyd2双敲除突变体转化子的筛选

3.2.16hyd1和hyd2融合表达标签菌株的筛选

3.2.17转化子的分子验证

3.2.18同源转化子表型分析

3.2.19孢子疏水性测定(MATH)

3.2.20凝集素结合试验(Lectin binding assay)

3.2.21孢子对不同介质吸附能力的测定

3.2.22免疫荧光检测疏水蛋白的表达和分布

3.2.23扫描电镜(SEM)观察孢子表面特性

3.2.24原子力显微镜(AFM)观察孢子表面特性

3.2.25hyd1和hyd2在形成孢子疏水层过程中的相互作用

3.2.26孢子抗逆性和耐热性测试

3.2.27生物测定

3.2.28数据的统计和分析

3.3 实验结果和讨论

3.3.1 疏水蛋白基因hyd1和hyd2侧翼序列的克隆和分析

3.3.2 hyd1和hyd2敲除载体的构建

3.3.3 hyd1和hyd2敲除菌株的筛选与分子验证

3.3.4 △hyd1和△hyd2互补菌株的筛选

3.3.5 △hyd1△hyd2双敲除菌株的筛选

3.3.6 同源重组转化子表型分析

3.3.7 孢子疏水性测定

3.3.8 hyd1在由液体介导的分生孢子的分散中起重要作用

3.3.9 hyd1和向hyd2编码蛋白形成在孢子外壁水疏水层

3.3.10免疫荧光分析hyd1和hyd2表达谱

3.3.11hyd1和hyd2在孢子外壁形成中的相互作用分析

3.3.12hyd1和hyd2在介导对不同底物吸附中的作用

3.3.13凝集素结合实验

3.3.14hyd1和Hyd2在形成孢子外壁中作用模型

3.3.15疏水蛋白在球孢子白僵菌致病中的作用

3.4 小结

4 结论

4.1 球孢白僵菌高效稳定转化子的筛选

4.2 疏水蛋白基因功能分析

致谢

参考文献

附录

A.本文中用到的菌株和质粒

B.本文中用到的引物

C.文中用到的缩写

D.博士学习期间在GenBank上登录的基因序列

E.博士学习期间发表的文章

F.博士期间参与的会议和发表的文章