细胞骨架与胞外渗透压相互作用的实验研究

摘要

渗透压作为最重要的环境影响因子之一，在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。干旱、高盐等逆境条件都能引起植物生长环境的渗透压变化，影响植物的细胞形态及生理代谢，导致植物生长发育改变及生长趋势改变。但植物细胞是通过哪些途径感受环境渗透压的变化，调节自身形态及生理生化功能，目前还不太清楚。本论文作为自然科学基金研究项目《细胞壁-质膜-细胞骨架连续体及钙离子信号在植物细胞机械力信号转导中的作用及相互关系》的一部分，着重研究环境渗透压的变化和植物细胞微丝、微管骨架动态变化的关系，分析植物细胞内微丝、微管在植物感受环境渗透压变化中的作用。
　　本课题首先以转基因GFP-FABD2(GreenFluorescentProtein-thesecondactin-bindingdomainofArabidopsisfimbrin)和转基因GFP-MBD(GreenFluorescentProtein–themicrotubulebindingdomainofmicrotubuleassociatedprotein4)及野生col-0型拟南芥种子诱导愈伤组织，然后通过正交实验优化培养液激素水平，建立转基因拟南芥悬浮细胞培养体系。将悬浮细胞包埋于低熔点琼脂中，涂布于底部带窗口的共聚焦玻皿，通过滴加甘露醇或蒸馏水改变细胞外环境渗透压，利用共聚焦显微镜、带CCD的光学显微镜实时观测胞外渗透压改变时细胞质的形态及细胞骨架的变化。最后，借助药理学方法干扰细胞骨架的正常功能，观察其荧光强度、渗透压改变时骨架的动态变化及原生质体收缩膨胀情况，并与未经药物处理细胞对比分析。通过以上研究，本课题共得到以下实验结果：
　　①FABD2转基因型拟南芥悬浮细胞最适培养基：MS+100mg/L肌醇+150mg/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.05mg/LNAA+0.05mg/LKT；MBD转基因型拟南芥悬浮细胞最适培养基：MS+100mg/L肌醇+150mg/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/LKT
　　②环境渗透压变化对微管骨架的影响：高渗环境下，原生质收缩、微管骨架解聚，解聚后微管蛋白分散于细胞质内，并伴随有聚集成斑；低渗环境下，细胞内原生质膨胀，细胞内的微管束增加
　　③环境渗透压变化对微丝骨架的影响：高渗环境下，原生质收缩，细胞中微丝骨架随原生质的缩小而聚拢，同时观测到原生质长轴两端“郝氏丝”，说明其含有肌动蛋白成分；在微丝收拢的同时，连接于细胞壁的“郝氏丝”被拉断解聚；低渗环境下，原生质膨胀，同时细胞内较细的微丝消失，细胞内出现弥散性绿色荧光，没有聚集成斑。
　　④微管骨架对细胞感受环境渗透压变化的影响：细胞骨架药物处理，导致细胞微管平均荧光强度增加。高渗环境下，细胞内微管骨架平均荧光强度越高，细胞内原生质收缩程度越强；低渗环境下，细胞内微管骨架平均荧光强度越高，细胞内原生质膨胀程度越弱。
　　⑤微丝骨架对细胞感受环境渗透压变化的影响：细胞骨架药物处理，导致细胞微丝平均荧光强度增加。高渗环境下，微丝骨架平均荧光强度与细胞内原生质的收缩情况未有表现出规律性；低渗环境下，细胞内微丝骨架平均荧光强度越高，细胞内原生质膨胀程度越强。
　　结合以上结果：我们认为当植物细胞培养环境渗透压变化时，微管、微丝的响应不同，微管、微丝在渗透压改变时参与原生质体体积改变的调节。

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缩写表

1 研究背景

1.1 拟南芥、渗透压及膨压、细胞骨架和GFP绿色荧光蛋白

1.2 细胞骨架的作用

2 前 言

2.1 提出课题的目的及意义

2.2 课题的研究内容及技术路线

3 拟南芥愈伤组织培养

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 实验结果及数据

3.4 数据分析与讨论

4 拟南芥悬浮细胞培养及优化

4.1 引言

4.2 拟南芥悬浮细胞培养

4.3 拟南芥悬浮细胞培养条件优化

4.4 本章小结

5 拟南芥细胞骨架及原生质对环境渗透压改变的响应

5.1 引言

5.2 细胞提纯

5.3 低熔点琼脂包埋细胞

5.4 共聚焦显微镜观察微管、微丝动态变化

5.5 显微镜观察原生质变化

5.6 实验结果与讨论

5.7 本章小结

6 细胞骨架对拟南芥单细胞响应环境渗透压变化的影响

6.1 引言

6.2 细胞骨架药物制备

6.3 悬浮细胞骨架药物处理及包埋

6.4 细胞骨架荧光强度测定

6.5 细胞骨架动态的共聚焦显微观察

6.6 光学显微镜观察细胞原生质变化

6.7 实验结果与数据

6.8 讨论

6.9 本章小结

7 总结及后续工作建议

7.1 主要结果

7.2 后续研究建议

致谢

参考文献

附 录

A. MS培养基配方

B. 主要实验仪器

C. 研究背景及相关资料

D. 发表论文及参与课题发表文章：