固定化腈水解酶选择性氧化R-扁桃腈的研究

摘要

在pH7.0条件下利用膜分离组件处理腈水解酶粗品，并添加0.5％蔗糖作为冻干保护剂冻干，得到纯化的腈水解酶，其酶活为69U。结合葡聚糖凝胶层析和SDS-PAGE电泳可知纯化的腈水解酶是分子量为21190Da的寡酶，该酶催化R,S-扁桃腈的最佳条件是：pH9.6，酶与底物的质量比为7:10，温度40℃，实验发现甲苯-水组成的两相反应大大提高了酶的催化效率，且甲苯与水最佳体积比为1:10。添加选择性吸附R-扁桃酸的717树脂有利于转移生成的R-扁桃酸，导致转化率的提高。
　　以D155树脂为基体，通过二环己基碳二亚胺与赖氨酸缩合，制备出L-D155树脂，再以L-D155树脂为载体，通过戊二醛分别与载体和腈水解酶形成席夫碱制备固定化腈水解酶。固定化酶红外分析表明D155树脂成功地通过酰胺键接枝了赖氨酸，N-L-D155在1671cm-1处出现的宽峰也证明腈水解酶通过席夫碱反应被成功固定在L-D155上。
　　腈水解酶的最佳固定化条件为：戊二醛、载体游离氨基与腈水解酶三者的摩尔比为：0.11:1:1.72×10-4，pH5.25，该条件下制备的固定化腈水解酶活力为10～15U，Km值为23.11mmol/L，偶联率为43.2%，其热稳定性有所提高，且连续使用5次后可保持85%活力。

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1引 言

1.1扁桃酸简介

1.2 光学纯扁桃酸的拆分方法

1.3腈水解酶简介

1.4固定化酶的研究及应用

1.5 本课题选题背景和研究意义

2实验原理

2.1扁桃酸和扁桃腈紫外法测定原理

2.2腈水解酶分子量测定

2.3油水双相反应

2.4固定化酶

2.5红外光谱

2.6核磁共振

3 实验仪器及试剂

3.1 实验仪器

3.2 实验试剂

4 实验方法

4.1腈水解酶的分离纯化

4.2 SDS－聚丙烯酰胺凝胶

4.3葡聚糖凝胶柱层析

4.4单相催化反应

4.5双相催化反应

4.6固定化腈水解酶的制备

4.7紫外法测定R-扁桃酸的含量

4.8产物光学纯度的检测

5 实验结果与讨论

5.1 腈水解酶的预处理

5.2游离酶制备R-扁桃酸

5.3固定化酶制备R-扁桃酸

5.4 产物的表征

致谢

参考文献