Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端结合抑制肽的筛选与序列分析

摘要

目的：利用Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)羧基端胞浆区的三个重要的功能结构域(CCT,CTAR23,CTAR2)对噬菌体随机12肽文库进行筛选，以发现能与LMP1蛋白羧基端各不同区段直接相互作用的特异性短肽，进而对筛选出的短肽进行氨基酸序列测定和序列分析。找出与LMP1蛋白羧基端不同片段相互作用短肽配体的共有序列，确定其关键区域、表位及共有氨基酸残基。为后续人工合成用于阻断已知和未知的LMP1蛋白与其他蛋白之间相互作用的小分子肽奠定实验基础。 方法：LMP1CCT,CTAR23，CTAR2结构域蛋白的表达与纯化：利用已构建的LMP羧基端的三个原核重组表达载体，在宿主细胞(BL21)中表达三个融合蛋白片段(GST-CCT，GST-CTAR23，GST-CTAR2)，用亲和层析和酶切的方法纯化后获得三个区段蛋白(CCT,CTAR23,CTAR2)，用核酸蛋白定量仪计算出浓度后，分别包被ELISA板孔，封闭后加入鼠源性LMP1单克隆抗体，待反应完全后再加入酶标二抗(HRP-羊抗鼠lgG)进行抗原特异性鉴定检测。一抗及酶标二抗的最佳工作浓度用棋盘滴定法确定。 1.筛选噬菌体随机肽库并进行阳性克隆鉴定：首先，用纯化的三个区段蛋白(CCT,CTAR23,CTAR2)分别包被ELISA板，使之固相化；然后将噬菌体短肽库分别加入上述板孔中，使噬菌体表面呈现的特定短肽与包被的三个蛋白发生结合作用，表面含有特异性结合作用短肽的噬菌体颗粒即从溶液中结合到固相孔板上。洗去未结合的噬菌体，再以非特异性洗脱液将结合的噬菌体从固相板孔上洗脱下来，同时将其感染宿主菌，于37℃剧烈摇动培养4.5小时，使噬菌体在宿主菌中得到扩增。收获扩增的噬菌体，再次分别与固相化的三个蛋白发生结合作用，重复上述“结合-洗脱-扩增”操作过程，进行3轮淘筛。最后，通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定。通过夹心ELISA方法分析噬菌体克隆与三个区段蛋白的亲和力。 2.阳性克隆DNA制备及测序分析：用最后筛选出的噬菌体阳性克隆制备DNA，交上海博亚公司对其进行测序，并依据此DNA序列推导出相应短肽的氨基酸序列，从而找出与三个片段相互作用短肽配体的共有序列，确定其关键区域、表位及共有氨基酸残基。 结果：1.三个区段蛋白(CCT,CTAR23,CTAR2)的浓度分别是200ug/ml，223ug/ml和208ug/ml。抗原特异性鉴定结果：包被纯化CCT,CTAR23,CTAR2三个区段蛋白的ELISA板孔的A值(依次为0.383，0.252，0.237)均超过只用封闭液封闭的板孔A值(依次为0.058，0.060，0.056)的2倍以上(P/N＞2.1)，判为阳性结果。 2.对肽库进行三轮筛选后，噬菌体克隆具有良好的富集效果，三个蛋白的第三轮产率分别是第一轮的140倍，67倍和178倍。硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％，通过ELISA方法检测到噬菌体克隆与三个区段蛋白(CCT,CTAR23,CTAR2)有高亲和力。 3.测序结果显示噬菌体上的短肽具有的共同序列分别为：IQMPPKWPWPAA，HVSLHKHYPTAS，GLKHHSPGLLLY。三者共有两个氨基酸“-K-P-”残基，它们可能是引起LMP1信号传导活性的最小和最必要的序列。而CCT与CTAR23两个阳性克隆序列共有“K-P-A”残基；CTAR23和CTAR2两个阳性克隆序列共有“L-KH-P”残基；序列“-K-P-”，“K-P-A”和“L-KH-P”，可能模拟了LMP1C端受体的配体通过折叠后在三级结构水平上形成的结合位点，很可能是LMP1羧基端与信号转导因子相互作用的关键区域之一。 结论：从噬菌体肽库中筛选到了与三个LMP1C端胞浆区区段蛋白有高亲和力的阳性噬菌体克隆，噬菌体表达的12肽IQMPPKWPWPAA，HVSLHKHYPTAS，和GLKHHSPGLLLY分别模拟了天然配体的结合部位与靶分子(CCT，CTAR23，CTAR2)结合，直接测知配体与受体的结合位点，为设计肿瘤疫苗提供了有力的前提。而且，这三个模拟配体位点可能与鼻咽癌细胞上表达的LMP1C端结合，从而阻断LMP1C端与其他细胞内信号转导分子或蛋白之间的信号转导通路，达到拮抗LMP1致瘤作用的目的。这为探明LMP1的致瘤机制，进一步研制开发生物抗癌药物及基因疫苗奠定良好的实验基础。

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综述噬菌体展示肽库技术及其应用*

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