荧光共振能量转移技术在SARS冠状病毒S蛋白介导的免疫损伤信号转导机制研究中的应用

摘要

目的： 活细胞在刺激因子作用下细胞内蛋白质分子间的相互作用以及由此而产生的信号转导是一个动态的过程，传统的免疫共沉淀等研究方法不可能进行可视性的、实时动态观察，因而可能丢失某些重要信息。因此，发展与建立一种能够在活细胞水平实时动态观察蛋白一蛋白之间相互作用的技术方法，对于研究生命过程细胞重要的病理生理反应及依赖的信号转导机制具有重要的科学应用价值。荧光共振能量转移 术的优势在于能够定位、实时动态检测活细胞内蛋白质间相互作用或蛋白质构像的变化，已经在生命科学领域研究生物大分子相互作用过程中显示出了其极大的应用拓展潜力。本课题通过建立以宽场荧光显微镜为基础的FRET测定技术平台，研究严重急性呼吸综合症冠状病毒刺突蛋白(Spike，S)蛋白介导免疫损伤的可能信号转导机制。 内容和方法： 一、宽场荧光显微镜下FRET稳态荧光强度测定的技术平台构建 1、构建青色荧光蛋白(Cyan Fluorescent Protein，CFP)和黄色荧光蛋白(Yellow FllJorescent Protein，YFP)的融合蛋白质粒，pCFP-YFP，设置为FRET检测阳性对照质粒；研究宽场荧光显微镜检测FRET的图像对齐及主要影响因素，推导FRET检测中图像对齐的数学模型，优化FRET结果。 2、分别用CFP和YFP标记雌激素受体alpha(Estrogen Receptor-α，ER α)构建pCFP-ER和pYFP-ER质粒，以探讨不同比例供受体对FRKT检测结果的影响。 3、构建pECFP-YFP和pEYFP-CFP荧光报告质粒，作为快速构建FRET检测的供受体荧光融合蛋白对的工具载体。 二、应用FRET技术研究SARS冠状病毒S蛋白介导的干扰素Gamma (InterferonGamma，IFN γ)可诱导的信号通路关键信号分子，信号转导和转录激活因子1(Signal TransdtJcer and Activation of TralqSCription 1， STAT1)的激活。 1、构建作为FRET供受体对的分别表达STAT1和STAT1突变体(STAT1701，即701位点突变使SH2功能域失活)荧光融合蛋白的质粒pSTAT1-CFP和pSTAT1-YFP等；应用FRET技术检测基础状态下活细胞内STAT1-STAT1的相互作用及IFN?或SARS冠状病毒S蛋白刺激下STAT1激活构像的改变。 2、应用电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)和RT-PCR方法进一步确证SARS冠状病毒S蛋白对IFNγ可诱导的信号通路关键信号分子STAT1的激活，以及对STAT1同源二聚体转录激活子的重要靶基因干扰素调节因子1(IFN regulated factor-1，IRF-1)的转录激活影响。 结果： 一、成功建立宽场荧光显微镜下稳态荧光强度测定检测FRET的技术平台： 1、通过比较图像对齐方法在FRET检测中的应用，以及旋转偏移对FRET结果的可能影响，推导了新的图像对齐数学模型，使之不仅能够校准水平偏移亦能够校准旋转偏移，经图像对齐后像素一像素解析的FRET结果明显改善。 2、探讨了宽场荧光显微镜下FRET检测的荧光渗漏及背景荧光的去除问题，建立了FRET效率检测的程序与方法，成功进行了图像标准化处理，经阳性模型验证表明：表达CFP-YFP融合蛋白阳性对照质粒转染细胞后经FRET测定计算后表现为强阳性，已知供受体荧光融合蛋白存在FRET关系的分别表达CFP-ER和YFP-ER 的质粒共转染细胞后FRET检测为阳性，而仅表达荧光蛋白CFP或YFP的空载质粒共转染细胞后FRET检测计算为阴性。 3、各种标准化FRET效率的方法都有一定的局限性，当供受体比例相似时，如分子内FRET，E描述效果最好，当比例相差较大时，N<,FRET>效果较好，FRETN不能很好的描述FRET效率。 4、成功构建pECFP-YFP和pEYFP-CFPFRET载体。 二、应用建立的宽场荧光显微镜FRET效率测定方法发现SARS冠状病毒S蛋白能够模拟INFγ激活STAT1信号分子，诱导干扰素可诱导的基因转录激活。 1、荧光显微镜下可以观察到转染pSTAT1-CFP或pSTAT1-YFP细胞的荧光主要分布于细胞浆，细胞核仅有少量表达。S蛋白或INFγ刺激后荧光转移至细胞核。分别单转pCFP-STAT1，pYFP-STAT1，pYFP-STAT1-CFP，pCFP-STAT1-YFP，pSTAT1701-CFP细胞的荧光分布基态下主要定位于细胞浆， INFγ刺激后荧光分布无明显变化。 2、共转染pSTAT1-CFP和pSTAT1-YFP质粒的1611BE基态下细胞核与细胞浆的FRET效率检测阳性，核浆FRET效率分布无明显差异，INFγ或S蛋白刺激后核内FRET效率降低而胞浆不变。共转染pSTAT1701-CFP和pSTAT1701-YFP质粒的16HBE细胞基态下FRET效率检测亦为阳性。相比之下，共转染pCFP-STAT1和pYFP-STAT1质粒的16HBE细胞FRET效率检测为阴性。 3、EMSA与RT-PCR实验结果证实：经INFγ刺激的的人支气管上皮细胞(HumanBronchial Epithelial Cell，16HBE)细胞核蛋白显著增强了与IRF-1基因启动子上的干扰素gamma激活序列(IFN Gamma Activated Sequence，GAS) DNA基序的结合，诱导了IRF-1基因的转录；共转染pSTAT1-CFP和pSTAT1-YFP质粒的16HBE细胞核蛋白进一步增强了与GAS的结合，并相应地增加了IRF-1基因的转录；共转染表达STAT1突变体的pSTAT1701-CFP和pSTAT1701-YFP质粒细胞下调了IRF-1基因的转录激活。 结论： 1、成功建立宽场荧光显微镜下稳态荧光强度测定检测FRET效率的技术平台，通过数学模型改良明显改善像素-像素解析的FRET结果，提高了FRET测定的准确性。 2、STAT1C末端连接CFP或YFP的荧光融合蛋白能够保持野生型STAT1生物学活性，FRET测定结果表明：基态下细胞内非激活形式的STAT1能够以同源二聚体的形式存在，INFγ或S蛋白刺激下STAT1同源二聚体入核，并发生了激活形式的构像改变，进而诱导了靶基因IRF-1的转录激活。研究发现SARS冠状病毒S蛋白能够激活INFγ激活的信号分子，诱导INFγ可诱导的免疫炎症反应相关核心因子的转录激活。

目录

中英文对照词汇表

前言

第一部分:FRET技术平台的构建

介绍

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分:FRET研究SARS冠状病毒Spike蛋白介导的STAT1-STAT1相互作用

介绍

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表1

附图表2

附图表3

参考文献

综述 荧光共振能量转移效率的测量及其在生物学中的应用

致谢

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