不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底对内皮细胞生物力学行为的影响

摘要

心血管疾病（CVD）是全球人口发病率和死亡率最高的疾病之一，而动脉粥样硬化（AS）则是主要的心血管类疾病之一。在动脉粥样硬化疾病发生发展过程中，由于血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖迁移、基质胶原大量沉积、细胞外基质蛋白交联等，血管壁硬度逐渐增加。随着刚度增加，血管壁内皮层渗透性增加，白细胞转移增加，这也是动脉粥样硬化病变过程的标志之一。目前，对动脉粥样硬化发病机理的研究多从 VSMCs、炎症细胞等入手，而从力学角度研究基底刚度与内皮细胞（ECs）相互作用的并不多见，血管病变过程中血管壁刚度的变化对血管内皮细胞的铺展、粘附、迁移等生物力学行为的影响及其可能的分子学机制，目前尚无定论。
　　为了弄清内皮细胞在动脉粥样硬化病变发展过程中对血管壁硬度变化的生物力学响应，从而更好地维护心血管的健康，本研究利用聚丙烯酰胺水凝胶（PA gel），设计制备不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底，模拟血管正常生理状态和病变不同阶段血管壁硬度，分析不同硬度基底对血管内皮细胞骨架组装、细胞铺展和迁移等行为的影响。在此基础上，通过对“细胞外基质—整合素—黏着斑—细胞骨架”这条与细胞铺展迁移密切相关的信号轴上关键蛋白表达及其在细胞内的分布，探寻基底硬度调控细胞铺展、迁移等行为的作用规律。
　　本文的主要内容和结果：
　　①聚丙烯酰胺凝胶基底的制备、表面修饰及表征。丙烯酰胺单体、甲叉双丙烯酰胺交联剂按不同配比聚合，动静态疲劳试验机测得不同配比丙烯酰胺水凝胶的杨氏模量E分别为11.12kPa、33.01kPa、57.61kPa、80.66kPa，可以较好的地模拟正常血管及病变血管的硬度。各硬度PA胶表面用I型鼠尾胶原（Col-I）修饰，原子力显微镜（AFM）扫描分析修饰后的凝胶表面形貌显示，PA胶表面粗糙度为1.682E+01nm，表面有锥形凸起，但最高不超过200nm。
　　②基底硬度对内皮细胞形貌、铺展、极化行为的影响。不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养，细胞免疫荧光分析细胞骨架纤维组装和排列随基质硬度的变化。在较软基底表面生长的细胞，细胞骨架纤维短小、纤细，无法形成明显纤维束，随着基底硬度增加，骨架纤维变长变粗，形成相互交联的网状纤维束，基底硬度越高，骨架纤维交联度也越高；在较高硬度基底上，细胞骨架纤维排列发生极化，排列方向与细胞长轴方向基本平行。利用活细胞工作站实时观察记录细胞形貌、铺展、极化随基底硬度的动态变化。在较软基底表面，内皮细胞呈圆形，铺展面积小，随着基底硬度增加，细胞在基底表面的铺展面积增大，细胞长短径比率增大；在80.66kPa的较硬基底上，细胞极化现象明显，呈梭型，并出现伸长的尾部。
　　③基底硬度对内皮细胞迁移行为的影响。不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底与内皮细胞共培养，活细胞工作站实时观察记录细胞迁移行为。单个 HUVEC细胞迁移速率和位移均随基底硬度增加而增大；细胞在软基底上运动比较随机，方向变化较快，而较硬基底表面，细胞运动更规律。
　　④基底硬度对细胞内力响应蛋白分布及含量的影响。人脐静脉内皮细胞分别在不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基底上培养48h，分别用免疫荧光和免疫印迹检测黏着斑蛋白vinculin和非肌肉型II型肌球蛋白（NM II）在细胞内的分布和表达情况。Vinculin表达量随基底硬度增加而单调增加；NM II呈点状弥散分布于细胞质中，且随基底硬度增加，其表达量增加。

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主要缩略词表

目录

1 绪 论

1.1 问题的提出与研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 本文的研究目的、研究内容和技术路线

1.4 本研究的创新点

2 聚丙烯酰胺水凝胶基底制备、表面处理及性能检测

2.1 引言

2.2 实验仪器与试剂

2.3 聚丙烯酰胺水凝胶基底制备、表面处理及性能检测

2.4 结果分析与讨论

2.5 本章小结

3 基底硬度对人脐静脉内皮细胞形貌、细胞铺展行为的影响

3.1 引言

3.2 实验仪器与试剂

3.3 不同硬度聚丙烯酰胺水凝胶基底对内皮细胞形貌、铺展行为影响

3.4 结果分析与讨论

3.5 本章小结

4 基底硬度对人脐静脉内皮细胞迁移行为的影响

4.1 引言

4.2 实验仪器与试剂

4.3 基底硬度对人脐静脉内皮细胞迁移行为的影响

4.4 结果分析与讨论

4.5 本章小结

5 基底硬度对内皮细胞相关力学响应蛋白分布及表达的影响

5.1 引言

5.2 实验仪器与试剂

5.3 基底硬度对内皮细胞相关力学响应蛋白分布及表达的影响

5.4 结果分析与讨论

5.5 本章小结

6 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 存在的不足和后续工作建议

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间发表的论文

B. 作者在攻读硕士学位期间曾参与的科研项目：