产乳酸的纤维素原料处理——固定化米根霉产果胶酶的研究

摘要

L-乳酸是生物医用高分子材料聚乳酸合成的单体。由于聚乳酸具有良好的生物相容性和可降解性，在生物医药和环保领域都得到广泛的关注。随着聚乳酸研究的迅速发展，乳酸的生产日益受到重视。米根霉由于具备营养需求低，产出的L-乳酸光学纯度高，易于分离等特点，成为了目前制备高光学纯度L-乳酸的主要菌种。然而米根霉发酵L-乳酸的工业化过程中底物成本是个难题。生物质资源—天然纤维素（烟梗等）由于成本低廉和来源丰富，被认为是生产乳酸的有效碳源。可是由于果胶将纤维素、半纤维素和木质素紧密的缠绕在一起，造成微生物利用天然纤维素生产乳酸的困难，增加了酶制剂的费用，削弱了节约原料费用的优势。一般生物质的非酸预处理方法对半纤维素和果胶的处理不够，而生物酶法和微生物法，能去除生物质中的果胶和半纤维素等。微生物（如米根霉等）产生的果胶酶能降解天然纤维素中的果胶，同时果胶酶被广泛用于食品、纺织、医药等领域，其市场需求量日益增长。
　　本文采用有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种—米根霉，使用实验室开发的棉布载体固定化细胞的技术进行发酵产果胶酶，以期实现半连续化产酶和降解烟梗果胶的目标，为米根霉利用烟梗生产乳酸做准备。首先从纯果胶发酵产果胶酶出发，研究了固定化发酵与游离两种方式，优化了纯果胶培养基和培养条件，模拟了单批次发酵菌体生长动力学行为，还进行半连续发酵实验；然后优化了烟梗浸出液培养基和培养条件，模拟了单批次发酵菌体生长动力学行为，还进行半连续发酵实验；最后将发酵粗酶液应用于降解烟梗果胶，还采用固定化米根霉发酵烟梗粉末的方法降解烟梗果胶。
　　首先，对纯果胶发酵产果胶酶进行研究。固定化与游离相比发酵周期减少33％，产酶量提高115%。通过对培养基和培养条件的优化得到：果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween800.15%，K2HPO40.4%，KH2PO40.4%，转速190r/min、装液量50mL/250 mL、发酵温度30oC、发酵p H5.0、孢子浓度0.75×106个/mL。在单批次发酵中，固定化米根霉生长动力学符合Logistic方程，生长与产酶部分偶联，24h后果胶酶（PEC）酶活力和聚半乳糖醛酸内切酶（Endo-PG）酶活力分别为973.47U/mL和165.08 U/mL。半连续发酵研究表明在第5批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为1253.95U/mL和181.94U/mL，分别比首次提高29.8%和18.3%，达到或高于目前固定化细胞产果胶酶的水平。
　　其次，对烟梗浸出液发酵产果胶酶进行研究。通过对培养基和培养条件的优化得到：烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6 mmol/L，Tween800.1%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%，发酵pH5.0，孢子浓度0.5×106，，发酵温度30oC，装液量50mL，转速170r/min。在单批次发酵中，发现固定化米根霉生长与产酶偶联，48 h后PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分别为361.27U/mL和49.22 U/mL。半连续发酵研究表明在第2批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为430.83U/mL和51.73U/mL，PEC酶活力比首批次提高22.8%。
　　最后，将发酵所得粗酶液应用于降解烟梗果胶的研究和采用固定化米根霉直接发酵烟梗粉末的方法降解烟梗果胶。纯果胶发酵所得粗酶液在酶活力600U/mL和液料比20时，烟梗果胶降解率为55.6%，纤维素相对含量提高130%。烟梗浸液发酵所得粗酶液在酶活力300U/mL和液料比15时，果胶降解率为37.5%，纤维素相对含量提高88%。烟梗发酵研究中，确定培养基为：烟梗2.0%，葡萄糖0.6%，硫酸铵0.3%， ZnSO40.6 mmol/L，Tween800.1%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%；在与烟梗浸液发酵相同培养条件下，24h后PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分别为342.10U/mL和52.67U/mL。固定化米根霉发酵烟梗粉末研究表明，96 h后烟梗果胶降解率为74.1%，半纤维素降解率为54.5%，纤维素降解率为13.3%。
　　总之，本研究基于米根霉利用木质纤维素原料中果胶和纤维素的先后顺序不同，期望在利用纤维素原料中果胶产果胶酶后，再进行纤维素的酶解液产乳酸。本研究实现了以橘皮果胶、烟梗为原料的固定化米根霉半连续产果胶酶和降解烟梗中大部分果胶的目标，不仅有利于解决乳酸生产过程中果胶带来的系列问题，还可以产生果胶酶，为米根霉利用天然纤维素资源生产乳酸提供了一种新的微生物的预处理方法。

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目录

1绪 论

1.1问题的提出及研究意义

1.2国内外研究现状

1.3本课题研究的目的及主要内容

2棉布载体固定化发酵产果胶酶的研究

2.1前言

2.2材料和方法

2.3结果分析

2.4讨论

2.5小结

3 固定化发酵果胶酶纯果胶培养基的优化

3.1前言

3.2材料和方法

3.3结果分析

3.4讨论

3.5小结

4纯果胶培养基半连续发酵果胶酶

4.1前言

4.2材料和方法

4.3结果分析

4.4讨论

4.5小结

5固定化发酵果胶酶烟梗浸液培养基的优化

5.1前言

5.2材料和方法

5.3结果分析

5.4讨论

5.5小结

6烟梗浸液培养基半连续发酵果胶酶

6.1前言

6.2材料和方法

6.3结果分析

6.4讨论

6.5小结

7生物酶法和微生物法去除烟梗中果胶的优化

7.1前言

7.2材料和方法

7.3结果分析

7.4讨论

7.5小结

8结论与展望

8.1结论

8.2对后续工作的展望

致谢

参考文献

附录

A．作者在攻读学位期间发表的论文目录

B．参与的科研项目