生理浓度糖皮质激素对内毒素诱导的心肌炎症的抑制作用及机制研究

摘要

背景 心力衰竭因其发病率、致残率、死亡率居高不下而严重威胁人类健康。心肌及间质重塑是心力衰竭重要的病理生理学基础，众多的试验及临床研究表明持续的炎症反应参与了心肌重塑的过程，甚至是心衰由代偿发展至失代偿的关键环节，因此预防及调控心脏损伤后炎症参与的心肌重塑的发生及发展显得由为重要。外源性药理剂量的肾上腺糖皮质激素（glucocorticoids，GCs）因其强大的抗炎作用长久以来广泛应用于临床用于治疗严重的炎症性疾病，但因伴有众多副作用使其应用受到限制，以往普遍认为生理水平的肾上腺GCs主要参与物质代谢作用，近年的研究发现生理水平的肾上腺GCs同样具有抗炎作用，其抗炎作用是通过GC-GC受体（glucocorticoids receptor，GR）途径增强核组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylase-2，HDAC2）的活性，从而抑制促炎核因子(nuclear factor-κB，NF-κB)和激活因子-1(activator protein-1，AP-1)的转录来实现的。最近关于慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的研究发现吸烟导致的氧化应激使肺组织HDAC2失活，取消了外源性肾上腺GCs的抗炎效应。这些结果提示氧化应激灭活HDAC使GC-GR抗炎通路受阻，是外源性肾上腺GCs的抗炎作用抵抗的机制之一，这种机制也很有可能削弱内源性肾上腺GCs的抗炎效应。是否这种内源性肾上腺GCs抗炎机制受损也参与了心脏损伤后的炎症过程？本室前期的工作发现内源性的肾上腺GCs对心脏炎症反应具有抑制作用，HDAC是内源性肾上腺GCs抑制心脏炎症反应的重要途径，抑制心脏HDAC功能是内源性肾上腺GCs抗炎作用抵抗的重要机制之一。提示GC-GR系统是动物和人体内重要的抗炎系统，其在正常生理状态下机体维持内环境的稳定。当机体受到急性严重刺激或慢性应激时，GC-GR通路受损，必然会影响其抗炎调控作用引起致炎与抗炎因素失衡，促进炎症参与的疾病的发展。然而，内源性的肾上腺GCs对心脏炎症反应抑制作用的细胞及分子水平的研究还不深入，本课题以成年Sprague-Dawley（SD）大鼠和培养的成年SD大鼠心肌成纤维细胞 (adult rat cardiac fibroblasts，ARCFs)为实验模型，从细胞和分子水平初步探讨内源性肾上腺GCs抗炎系统受损的具体机制，为内源性抗炎机制受损参与心肌间质重塑的病理生理机制研究提供新的思路和线索。通过阻断内源性抗炎作用受损可能会减慢心肌重塑的进展和临床心衰的发展，为心力衰竭的治疗提供新的策略。 第一部分 生理浓度肾上腺糖皮质激素对LPS诱导的心肌成纤维细胞炎症的抑制作用研究 目的 1.探讨内源性GCs对心肌组织炎症的抑制作用及作用的主要细胞靶点； 2.探讨体外生理浓度GCs对ARCFs炎症的抑制作用及GCs抗炎作用抵抗的机制。 方法 1.体内试验：SPF级SD雄性大鼠随机分为五组，正常对照组，摘双肾肾上腺(adrenalectomy，ADX)组，腹腔注射内毒素 (lipopolysaccharides，LPS)组，ADX+LPS组和ADX给予补充生理水平氢化可的松后再注射LPS组。取各组心脏冰冻组织切片进行炎症因子白介素-1β (interleukin，IL-1β) 免疫组织化学染色，观察LPS诱导的心脏炎症反应的组织学变化及细胞定位及内源性GCs的作用。 2.体外试验：以培养的成年SD大鼠ARCFs为实验模型；应用不同浓度的LPS刺激成纤维细胞产生炎症反应，双抗夹心酶联免疫吸附测定 (enzyme linked immuosorbent assay，ELISA) 炎症因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α)，IL-1β，IL-6；观察生理及药理浓度的氢化可的松抗炎作用；应用黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤系统 (xathaine oxidase/xathaine，XO/X) 制备成纤维细胞氧化应激模型，观察氢化可的松抗炎作用是否发生抵抗，同时应用荧光化学法及Western Blot法检测氢化可的松抗炎作用通路中重要的HDAC2表达及活性变化。 结果 1.LPS诱导的心肌组织冰冻切片免疫组化 IL-1β阳性细胞主要是分布在心外膜，心内膜，肌束膜，心瓣膜及血管周围的结缔组织的ARCFs，还有部分血液炎症细胞。在摘双肾肾上腺组LPS诱导的心肌淋巴细胞计数和IL-1β阳性细胞计数较ADX组及单纯LPS组明显增加（P<0.0001），给予预补充生理浓度的氢化可的松后，LPS诱导的摘双肾肾上腺组心脏炎症反应较前减少（P<0.0001）。 2.LPS浓度及时间依赖的增加ARCFs炎症因子产生（1ng/ml组P＞0.05，其余各组P<0.05），生理浓度的氢化可的松可以抑制LPS的作用（P<0.0001）。黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤系统浓度依赖的降低HDAC活性（P<0.0001）及HDAC2表达（黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤1u/0.5mM组P＞0.05，其余各组P<0.05），削弱生理浓度的氢化可的松对LPS诱导的ARCFs炎症的抑制作用，黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇可以保存HDAC活性，部分恢复生理浓度的氢化可的松的抗炎作用（P<0.05）。 小结 1.体内试验表明内源性肾上腺GCs抑制LPS诱导的心脏炎症反应，ARCFs是主要参与炎症反应的心脏细胞。 2.体外试验表明生理浓度的GCs抑制LPS诱导ARCFs炎症因子生成。 3.生理浓度的GCs通过增强HDAC功能来抑制ARCFs炎症反应，氧化应激导致HDAC2表达及活性降低是生理浓度的GCs抗炎作用减弱的机制之一。 第二部分 生理浓度肾上腺糖皮质激素对炎症因子诱导ARCFs增殖的抑制作用及机制研究 目的 观察体外生理浓度GCs对炎症因子诱导的ARCFs增殖的影响及机制研究。 方法 以培养的ARCFs为实验模型，应用炎症反应产物TNF-α，IL-1β及血管活性物质血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）诱导成纤维细胞增殖，CCK-8法测定各组OD值，观察生理浓度的氢化可的松（127ng/ml）及GR拮抗剂RU486 （100nM）对ARCFs增殖的影响。同时应用细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated protein kinase1/2，ERK1/2）抑制剂U0126 (100nM)和NF-κB抑制剂PDTC (1μM)观察对心肌成纤维细胞增殖的影响，并采用Western blot方法观察氢化可的松对炎症促增殖通路调控蛋白ERK1/2，细胞周期蛋白D1（CyclinD1），NF-κB及IκB的影响。 结果 1.不同浓度的TNF-α（10-105 pg/ml），IL-1β（10-104 pg/ml）孵育细胞48h，浓度依赖的促进ARCFs增殖，生理浓度的氢化可的松能够抑制炎症因子的促增殖作用，而RU486预处理可以部分拮抗生理浓度的氢化可的松的上述作用。 2.应用ERK1/2抑制剂U0126和NF-κB抑制剂PDTC可以拮抗炎症因子诱导的ARCFs增殖。 3.生理浓度的氢化可的松能够抑制炎症因子诱导的CyclinD1表达，ERK1/2及IκBa的磷酸化和NF-κB的核转位。 小结 1.生理浓度的肾上腺GCs能够抑制炎症因子诱导的ARCFs增殖。 2.生理浓度的肾上腺GCs抑制增殖是通过受体途径实现的，部分通过调节炎症因子增殖通路调控蛋白如ERK1/2的磷酸化及NF-κB的转位来实现。 结论 1.内源性GCs对LPS诱导的SD大鼠心脏炎症反应有保护作用，ARCFs是心脏炎症反应的主要效应细胞； 2.体外试验表明生理浓度的GCs抑制LPS诱导ARCFs炎症因子生成； 3.生理浓度的GCs通过增强HDAC功能来抑制ARCFs炎症反应，氧化应激导致HDAC2表达及活性降低是生理浓度的GCs抗炎作用减弱的机制之一； 4.生理浓度的肾上腺GCs通过受体途径抑制炎症因子体外诱导的ARCFs增殖，部分通过调控炎症因子增殖通路蛋白如ERK1/2的磷酸化及NF-κB的转位来调控实现。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文词汇对照表

声明

前言

第一部分 生理浓度糖皮质激素对LPS诱导的心肌成纤维细胞炎症的抑制作用研究

第二部分 生理浓度糖皮质激素对炎症因子诱导的心肌成纤维细胞增殖的抑制作用及机制研究

全文结论

参考文献

附图

综述 糖皮质激素抗炎抵抗机制研究进展

致谢