高分辨率熔解曲线分析技术在单基因遗传病诊断和产前诊断中的应用

摘要

第一篇 α-地中海贫血是人类最常见且危害最大的单基因遗传病之一。是一组由于α-珠蛋白基因缺失或突变使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血。因血红蛋白Bart’s 水肿胎的致死性，临床上出生后最严重的α-地中海贫血类型是血红蛋白H 病（Hb H 病）。Hb H 病常见的2 种类型为：缺失型Hb H 病和非缺失型Hb H 病。前者比后者多见，但后者表现出更严重的临床表现：患者贫血更严重、易出现肝脾肿大和需要输血的次数增加。在α0-地贫携带率高的地区，当夫妇一方为--/αα时，排除另一方为非缺失型α+-地贫携带者，对指导优生和预防重型Hb H病患儿的出生具有重要临床意义。我国常见的导致非缺失型Hb H 病的非缺失型α+-地贫是Hb Constant Spring(Hb CS)和Hb Quong Sze(Hb QS)。目前国内通过毛细管血红蛋白电泳或高效液相色谱法可筛查Hb CS，但由于Hb QS 极不稳定，这2 种方法不能筛查Hb QS。国内外常用反向斑点杂交、限制性酶切片段长度多态性和直接测序等基因诊断Hb QS。但这些方法具有操作繁琐、费用高等缺点，不适于大样本筛查。本研究探讨一种高效、快速的Hb QS 基因筛查方法。 一、目的: 探讨高分辨率熔解曲线分析技术用于筛查非缺失型α+-地中海贫血Hb QuongSze的可行性，建立一种快速、简便、廉价的Hb QS 分子筛查方法。 二、方法: 1.选取2007年至2010年期间，在广州市妇女儿童医疗中心优生围产研究所行地中海贫血基因检查的58 例样本，均应用gap-PCR 方法检测中国人常见的3 种缺失型α-地贫（--SEA、-α4.2、-α3.7）和反向斑点杂交技术检测非缺失型α-地贫。其中外周血55 例，产前诊断的胎儿脐带血3 例。 58 例样本中，携带Hb QS 基因突变者21例，其中11例杂合型Hb QS （αQSα/αα），9 例Hb H-QS (αQS α/--SEA）,1例Hb QS-α4.2 (αQS α/-α4.2）；37 例为随机正常人样本(αα/αα)。 2.设计引物同时特异性扩增α1-和α2-珠蛋白基因第3 外显子包含第125 密码子位点的区域。 3.优化PCR 反应，使PCR 反应成功扩增并获得特异性目的片段。 4.高分辨率熔解曲线分析技术（HRM）分析PCR 扩增产物，获得熔解曲线。应用LightScanner Software with Call-IT 2.0 软件分析数据。 三、结果: 1.58 例样本均成功扩增，并获得HRM 熔解曲线。 2.HRM 分析法成功检测出全部21例α2-珠蛋白基因p.L125P 突变，其中11例杂合型Hb QS （αQS α/αα）集成一簇，9 例Hb H-QS （αQS α/--SEA）和1例Hb QS-α4.2 （αQS α/-α4.2）集成一簇，37 例正常对照（αα/αα）集成一簇。 四、结论: HRM 分析技术能快速、准确筛查Hb QS，并具有简单、廉价、快速、高通量等优点。 第二篇:胎儿短肢发育异常是一组以长骨缩短为共同特征的骨骼发育异常疾病群，除少数染色体病之外，绝大多数是体质性骨病（constitutional bone disease）。胎儿短肢发育异常可分为致死性和非致死性骨发育不良两大类。致死性骨发育不全（Thanatophoric dysplasia，TD （OMIM187600，OMIM187601）），是常见的致死性骨骼发育不良疾病，属常染色体显性遗传病，发生率约为活产的0.21～0.30/10 000。 主要表现为严重短肢、短指/趾、头大、前额突出、鼻梁塌陷、胸廓狭窄、小肋、腹膨隆、扁平椎及躯干长度正常等。根据放射学和临床特征，TD 分为2 类：TD I和TD II。TDI 患者多在孕期经超声检查发现，产前超声对部分TDI 患者具有良好的诊断价值，但由于部分TDI 患者仅表现四肢粗短，超声征象缺乏特异性，往往难于与其他短肢发育异常类型鉴别从而无法确诊。基因检测是诊断短肢胎儿的最佳标准。 TDI 与FGFR3 基因突变有关，73%的TD Ⅰ是由FGFR3 基因p.R248C、p.S249C和p.Y373C 3 种错义突变所致。本研究应用HRM 分析法检测FGFR3 基因c.742 C → T 突变，以期建立1一种TDI的快速分子诊断方法。 一、目的: 探讨高分辨熔解曲线分析法用于 FGFR3 基因p.R248C 突变检测的可行性。以期建立1种TDI的快速分子诊断方法。 二、方法: 1.选用经直接测序确诊基因型为p.R248C的致死性骨发育不全Ⅰ型（type 1thanatophoric dysplasia，TD Ⅰ)样本 10 例和 30 例随机正常对照样本。 2.设计引物扩增 FGFR3 基因第7 外显子中包含 c.742C＞ T (p.R248C)位点的区域。 3.优化PCR 反应，使PCR 反应成功扩增并获得特异性目的片段。 4.高分辨率熔解曲线分析技术（HRM）分析PCR 扩增产物，获得熔解曲线。应用LightScanner Software with Call-IT 2.0 软件分析数据。 三、结果: 应用高分辨熔解曲线分析法成功检测出 10 例FGFR3 基因p.R248C 杂合突变。 四、结论: 高分辨熔解曲线分析法是1种具有简单、快速、高效、廉价和高通量等优点的新的分子遗传学分析法，能对FGFR3 基因的p.R248C 突变进行快速基因诊断。

目录

论文说明：缩略词表

声明

第一篇 应用高分辨率熔解曲线分析技术检测血红蛋白（Hb）Quong Sze

第二篇 建立一种快速分子诊断致死性骨发育不全I 型的方法

第三篇 应用HRM 技术快速产前诊断致死性骨发育不全I 型2 例报告

综述 高分辨率熔解曲线分析技术用于突变扫描和基因分型的研究进展

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