EIF2α磷酸化对长波紫外线诱导的小鼠角质形成细胞氧化损伤中Nrf2-HO-1通路的影响

摘要

背景：紫外线辐射是导致急、慢性皮肤损伤，皮肤光老化甚至皮肤肿瘤的的一个主要的环境因素。它主要是通过激活相关信号通路诱导基因的表达和一些蛋白的重新编程,从而参与皮肤疾病发生发展的过程。真核翻译起始因子eIF2α是参与这一过程的主要的调控因子，eIF2α磷酸化能够抑制细胞内大量蛋白的合成，选择性的激活某些蛋白的合成，从而减轻内质网负荷。但是过量的内质网应激会诱导eIF2α磷酸化激活Chop和Caspase家族蛋白的表达最终诱导细胞凋亡。eIF2α磷酸化是生物适应环境变化的一种有效的方式，在应对外界刺激过程中起到了重要的作用。UVA能够诱导质网应激，激活PERK磷酸化从而诱导其下游eIF2α发生磷酸化起到保护的作用。另外 UVA辐射做为一种氧化应激能够诱导 ROS的产生，引起氧化损伤激活一系列的抗氧化通路的激活，其中重要的通路之一是诱导 Nrf2-HO-1抗氧化通路。UVA能够激活Nrf2并且促进其转核，结合抗氧化反应原件（ARE）促进下游的抗氧化酶（HO-1、SOD、NQO1等）Ⅱ期解毒酶的合成。其中血红素氧合酶HO-1是催化血红素的起始酶和限速酶，它能够催化血红素，产生具有抗氧、抗炎作用的铁蛋白，一氧化碳(CO)以及胆红素。已有的研究表明 UVA能够诱导eIF2α磷酸化以及激活Nrf2-HO-1通路的表达两种保护机制，然而目前关于对于内质网应激和氧化应激之间的关系研究较少，且对于两条信号通路之间的作用机制也不十分清楚。因此研究eIF2α磷酸化在UVA诱导的氧化损伤中Nrf2-HO-1表达中的作用以及其对UVA诱导的氧化损伤中的保护作用具有重要意义。
　　目的：采用不同剂量的UVA（50、100、150、200、250 kJ/m2）辐射小鼠角质形成细胞（JB6），检测UVA的氧化损伤作用；验证UVA能够诱导eIF2α磷酸化，验证UVA能够激活Nrf2-HO-1通路；验证的Salubrinal，GSK2606414对 eIF2α磷酸化的作用并筛选出最佳的药物浓度；探索3μM的 Salubrinal，0.5μM的 GSK2606414分别预处理对150 kJ/m2UVA辐射细胞对 Nrf2，Bach1，H0-1 mRNA的影响；探索 Salubrinal， GSK2606414分别预处理对150 kJ/m2UVA辐射细胞后Grp78，Nrf2，Bach1，HO-1， P-eIF2α，eIF2α蛋白水平的影响；探索eIF2α磷酸化的改变对细胞形态，细胞活力，细胞内ROS的水平以及细胞周期的影响，探讨在UVA造成的氧化损伤中eIF2α磷酸化的保护作用。
　　方法：采用：MTS检测UVA对JB6细胞活力的影响； FITC-DAPI免疫荧光染色法检测不同剂量的UVA对JB6细胞形态的影响；DCFH-DA荧光探针检测eIF2α磷酸化改变对细胞内ROS的影响；实时定量PCR检测Nrf2、Bach1、HO-1的表达的影响； Western blotting检测Grp78、Nrf2、Bach1、HO-1、P-eIF2α、eIF2α蛋白表达的改变；流式细胞术检测eIF2α磷酸化改变对细胞周期的影响。
　　结果：⑴长波紫外线UVA辐射能够诱导JB6细胞氧化损伤，且损伤程度呈剂量依赖性：与未辐射组相比，细胞形态，细胞活力在小剂量50kJ/m2UVA辐射时无明显的影响（P>0.05）。100、150、200、250 kJ/m2UVA辐射之后随剂量的增加细胞碎片增多，细胞活力显著性降低且具有统计学差异（P<0.05）。⑵与未辐射组相比，不同剂量的UVA（50、100、150、200、250 kJ/m2）能够诱导eIF2α磷酸化，磷酸化程度随着UVA剂量的增加而增高，在250 kJ/m2的剂量辐射较200 kJ/m2的磷酸化程度稍微有所降低。因此我们选择中等生理剂量的150 kJ/m2UVA辐射JB6细胞检测不同时间点eIF2α的磷酸化情况，与未辐射组相比， UVA辐射之后 eIF2α磷酸化即刻增加且程度最高，随着时间的延长磷酸化程度下降。⑶与未辐射组相比，随着 UVA剂量的增加，Nrf2蛋白水平显著增加，但250 kJ/m2UVA辐射有所降低。而HO-1蛋白水平随着UVA剂量的增加而显著增加。选择150 kJ/m2UVA辐射JB6细胞后检测不同时间点Nrf2，HO-1基因和蛋白水平的改变，Nrf2，HO-1的转录水平随着时间点的增加而增加Nrf2在4h达到高峰，HO-1在12h达到最高峰。Nrf2，HO-1的蛋白水平先增加后降低， HO-1的蛋白水平在12h达到高峰。⑷与对照组相比，Salubrinal预处理对细胞活力未发现显著性影响（P>0.05）。与对照组相比，不同浓度的 GSK2606414预处理细胞活力未发现显著性影响（P>0.05）。不同浓度Salubrinal预处理对150 kJ/m2UVA辐射JB6细胞eIF2α的磷酸化具有增强的作用呈现出剂量的依赖性，但在5μM的浓度下较3μM组eIF2α的磷酸化稍微有所降低。不同浓度GSK2606414预处理对150 kJ/m2UVA辐射JB6细胞eIF2α的磷酸化具有抑制作用，在0.5μM时磷酸化程度最低。⑸3μM Salubrinal预处理联合150 kJ/m2UVA辐射与单独150 kJ/m2UVA组相比eIF2α磷酸化增加，0.5μM GSK2606414预处理联合150 kJ/m2UVA辐射与单独150 kJ/m2UVA组相比eIF2α磷酸化降低。Salubrinal联合UVA组较单独UVA辐射组对Bach1，Nrf2，HO-1基因水平影响不大，可以促进Grp78蛋白表达，、诱导Nrf2、HO-1蛋白表达延迟。GSK2606414联合UVA组较单独UVA组延迟Grp78表达，诱导Nrf2,HO-1蛋白表达提前。⑹与未辐射组相比，3μM Salubrinal预处理，0.5μM GSK2606414预处理对细胞活力无显著性影响。与150 kJ/m2UVA辐射组相比，3μM Salubrinal预处理联合150 kJ/m2UVA辐射细胞的活力增加，0.5μM GSK2606414预处理联合150 kJ/m2UVA辐射细胞的活力降低。与未辐射组相比，3μM Salubrinal预处理，0.5μM GSK2606414预处理对细胞周期无显著性影响，与150 kJ/m2UVA辐射组相比，3μM Salubrinal预处理联合150 kJ/m2UVA辐射细胞周期 S期增加7.28±1.03（P<0.05），0.5μM GSK2606414预处理联合150 kJ/m2UVA辐射细胞的周期S期降低差异不显著。
　　结论：UVA辐射能够激活内质网应激，诱导eIF2α磷酸化且eIF2α磷酸化呈现出剂量和时间的依赖性。UVA辐射作为一种氧化应激也能够诱导 Nrf2-ARE通路的激活且也呈现出剂量和时间的依赖性。使用Sal预处理能够维持eIF2α磷酸化，使用GSK2606414能够抑制eIF2α磷酸化。eIF2α磷酸化参与Nrf2-HO-1通路的调控。维持eIF2α磷酸化的增加能够减轻UVA诱导的氧化损伤，促进细胞的增殖。而抑制eIF2α磷酸化会加重UVA诱导的氧化损伤抑制细胞的增殖。

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缩略词表

1 绪 论

1.1 问题提出与研究意义

1.2 国内外研究现状

1.3 本文研究的目的和研究内容

1.4 本文的创新点

2 长波紫外线诱导小鼠角质形成细胞氧化损伤模型的建立

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 相关实验方法

2.4结果

2.5 讨论

3 UVA辐射诱导的内质网与氧化应激的研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 相关实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

4 EIF2α磷酸化对NRF2-HO-1通路的影响

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 相关实验方法

4.4 实验结果

5 EIF2α磷酸化对JB6细胞生物学功能的影响

5.1引言

5.2实验材料

5.3相关实验方法

5.4实验结果

5.5 讨论

6结论与展望

6.1 本研究主要结论

6.2 后期研究展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在硕士期间发表的论文目录

B. 作者在硕士期间参与的项目

C. 作者在硕士期间取得的其他实验结果