蝎毒促增殖肽(BmKpp)对小鼠的辐射保护作用研究

摘要

背景和目的：
　　目前，超过50％的肿瘤病人在病程中需接受放射治疗，电离辐射（Ionizing radiation,IR）会导致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的产生，最终导致细胞的DNA、蛋白质及脂质等成分损伤。骨髓造血抑制是放疗的常见副作用，这个副作用主要表现为造血干/祖细胞的增殖能力下降，部分病人可以表现为持续的髓系造血抑制或骨髓功能衰竭，这提示HSCs自我更新能力的缺陷及HSCs数量的下降。IR也会导致胃肠道损伤，主要是肠道绒毛的损伤及肠粘膜屏障功能的破坏，IR导致胃肠道出血、内毒素产生、细菌感染、腹泻及水电解质紊乱。虽然电离辐射损伤（Ironizing radiation injury，IRI）在临床上已经得到充分证实，其机制的研究结果也在不断积累，但对IRI的有效预防及治疗还是不足，因此亟待研发出新的可以在临床和辐射事故等应用的对抗辐射损伤的药物。本课题在前期工作的基础上深入研究和探讨蝎毒促增殖肽（Buthus martensii Karsch proliferation peptide，BmKpp）对全身辐射（Total body irradiation，TBI）后小鼠造血及肠道功能恢复的影响及机制，为开发治疗辐射损伤的新药提供理论基础及实验依据。
　　材料与方法：
　　1. BmKpp组分LD50测定：取昆明小鼠进行急性药物毒性试验，按0.0245 mg/kg-0.5000mg/kg浓度腹腔给药，据各组动物死亡情况，结果按Bliss法程序统计处理，计数BmKpp的LD50。
　　2. BmKpp最佳浓度筛选：C57BL/6小鼠，TBI(6Gy,X线辐射)（200cGy/min)，辐射前后按2.10~5.25μg/kg浓度腹腔给药，28d后分析动物生存情况。
　　3. BmKpp与SVPII对辐射后小鼠生存的影响：C57BL/6小鼠，经TBI（7.5GyX线辐射，200cGy/min）后，分为3组：A.辐射对照组（IR+，下同）：注射生理盐水；B. IR++SVPII：SVPII100μg/kg；C. IR++BmKpp：BmKpp2.63μg/kg。观察两药对TBI后小鼠体重、生存率及毛发等的影响。
　　4. BmKpp对辐射后小鼠骨髓造血恢复的支持作用：①实验动物同前。分为3组：A.正常对照组（IR-，下同）；B. IR+：经TBI（4Gy X线辐射,200cGy/min，下同）后，注射生理盐水；C. IR++BmKpp：辐射后注射BmKpp2.625μg/kg。于TBI后第5、7、14及28d对小鼠骨髓有核细胞(Bone marrow nucleated cells，BMNCs)、血常规进行分析；②体外培养实验分4组：A. IR+； B：IR++IL-3；C:IR++SVPII；D:IR++BmKpp，对小鼠BMNCs进行集落形成单位数（Colony forming-unit，CFU）分析及长期骨髓细胞培养。
　　5. BmKpp对辐射后小鼠肠道损伤的保护作用：实验动物、分组及处理同前。经(4Gy X线辐射,200cGy/min)后5h，脱臼处死小鼠，取出靠近幽门部小肠组织，分别用TUNEL法检测辐射后小鼠小肠绒毛固有层细胞的凋亡情况；TBI5d后脱臼处死小鼠，取出靠近幽门部小肠组织，制作病理切片，HE染色观察小鼠肠道隐窝细胞面积、隐窝细胞数量及隐窝细胞密度变化。
　　6. BmKpp辐射保护作用的机制探讨：实验动物同前及处理方法同前，照射剂量为4.0Gy（X线辐射，200cGy/min)。在动物辐射前及辐射后7d、14d或28d分离小鼠BMNCs，Annexin-V/Sca-1双染法观察细胞凋亡，荧光探针DCFH-DA法检测细胞内ROS水平，磷酸化H2AX检测评估DNA断裂情况，Real-time PCR定量分析P16、P21 mRNA表达，流式细胞仪检测P16、P21蛋白表达，β-半乳糖苷酶活性检测了解辐射后体外长期培养小鼠骨髓细胞衰老情况。
　　结果：
　　1．BmKpp的LD50和有效浓度的确定：BmKpp的LD50为0.105mg/kg；小鼠体内腹腔注射浓度为2.625μg/kg(1/40 LD50)时无明显毒性，且能对TBI后的C57BL/6小鼠发挥最佳的辐射保护作用，故确定2.625μg/kg为BmKpp为有效浓度并用于后期动物实验。
　　2．BmKpp对辐射后小鼠生存情况的影响：经BmKpp处理后，经致死剂量（7.5Gy） TBI后小鼠的长期生存率从IR+组的0提高至40%，并显著延长了小鼠的平均生存时间，有统计学差异（p<0.05）。SVPII也能延长小鼠的生存时间，但是没有BmKpp显著。在TBI后长达1年的观察中发现，BmKpp处理小鼠的毛发变白情况较IR+组及SVPII处理组明显减轻（p<0.05）。
　　3.BmKpp对辐射后小鼠造血恢复的促进作用：BmKpp能显著提高TBI后小鼠BMNCs数，各时间点与IR+组相比，均明显优于IR+组（p<0.05），且BmKpp组骨髓BMNCs在照射后第14d即恢复至辐射前水平（p>0.05）；BmKpp能促进TBI后白细胞总数、中性粒细胞数及血小板数的增加，其中白细胞数在 TBI后28d恢复正常，中性粒细胞数及血小板数TBI后14d恢复正常，明显优于IR+组（p<0.05）。集落形成单位计数分析显示，SVPII与BmKpp组的细胞集落较IR+组及IL-3组密集，体积更大，且在第7及14d CFU数均明显优于IR+组及IR++IL-3组（p=0.001）,另外，SVPII及BmKpp可以令辐射后小鼠骨髓细胞长期体外培养至8w,且其集落细胞数较IR+组及IR++IL-3组多(p<0.05)，提示BmKpp具有促进TBI后小鼠造血细胞增殖，促进造血恢复的作用。
　　4.BmKpp对辐射后小鼠肠道损伤的保护及促进修复作用：Bmkpp能增加TBI后小肠隐窝面积，促进 TBI后小肠隐窝细胞再生及增殖，并减少 TBI后小肠绒毛固有层内细胞凋亡，与IR+组相比，p<0.05。提示BmKpp具有减低TBI后小鼠放射性肠炎程度，促进小肠粘膜损伤修复的作用。
　　5. BmKpp辐射保护作用机制的探讨：BmKpp能降低TBI后小鼠BMNCs ROS水平，并抑制 TBI诱导的细胞凋亡作用，降低辐射后小鼠骨髓长期培养细胞的衰老细胞比例，与TBI后IR+组相比具显著性差异（p<0.05）；Bmkpp的作用下，TBI后小鼠的γH2AX的荧光强度在第7d及14d均低于IR+组（p<0.05），提示Bmkpp具有减少辐射后DNA损伤或促进DNA修复的作用；实时荧光定量PCR分析p16及 p21 mRNA表达水平，结果提示BmKpp对TBI后小鼠BMNCs的p16及p21 mRNA相对表达量的影响与IR+组相比，呈先升后降的变化（p<0.05）；在28d时对BMNCs的P16及P21蛋白分析结果也表明，BmKpp能降低辐射后小鼠衰老相关蛋白的表达，这对于TBI后促进DNA修复及减少衰老的发生具有重要意义。
　　结论：
　　1．BmKpp的LD50为0.105mg/kg，动物实验体内腹腔注射浓度为2.625μg/kg(1/40 LD50)时无明显毒性，且能对TBI后的C57BL小鼠发挥最佳的辐射保护作用。
　　2．BmKpp可促进辐射后小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖，缩短TBI后小鼠BMNCs以及外周血白细胞、中性粒细胞及血小板的恢复时间缩短，BmKpp也可促进辐射后小鼠肠道组织的修复，并最终通过促进造血及胃肠道功能的恢复达到延长辐射后小鼠寿命，提高生存率。
　　3.BmKpp能有效降低小鼠BMNCs内ROS水平，减轻DNA损伤，促进DNA损伤后修复，并且降低BMNCs的凋亡率，减少衰老细胞比例，其CDKI p16及p21的表达量呈先升高后降低的变化趋势。BmKpp可能通过ROS-p16/p21途径减少TBI后机体ROS产生，减轻辐射诱发的DNA损伤，促进DSB修复，降低细胞的凋亡比例，从而发挥其辐射保护作用。

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封面

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缩 略 词

中文摘要

英文摘要

前 言

实验动物与实验材料

1.实验动物与实验材料

实验方法

1. 蝎毒促增肽BmKpp的LD50测定

2. BmKpp最佳浓度筛选

3. BmKpp与SVPII对辐射后小鼠生存的影响

4. BmKpp对辐射后小鼠骨髓造血功能的影响

5. Bmkpp对辐射后小鼠急性胃肠道损伤的保护作用

6. BmKpp对辐射后小鼠BMNC凋亡的影响

7. BmKpp对辐射后小鼠BMNC活性氧水平的影响（荧光探针DCFH-DA法检测）

8. BmKpp对辐射后小鼠BMNCs DNA双链断裂的影响

9. BmKpp对辐射后小鼠骨髓细胞p21及p16mRNA表达的影响

10. BmKpp对辐射后小鼠骨髓细胞p21及p16蛋白表达的影响

11.统计学方法

结 果

第一部分 BmKpp毒性鉴定和有效剂量筛选

1.BmKpp的LD50和最佳剂量确定

2. BmKpp的辐射保护作用

3. BmKpp辐射保护作用机制的探讨

讨 论

1. BmKpp具促进TBI后小鼠造血恢复的作用

2.BmKpp对TBI后小鼠肠道损伤的保护作用

3.BmKpp对小鼠的辐射保护作用机制研究

结 论

参考文献

综 述

附 录

致谢

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