乌拉坦诱导小鼠肺癌变过程中lncRNA表达改变

摘要

背景与目的：
　　长片段非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，不具有编码蛋白质功能，但在基因表达调控方面发挥着十分重要的作用。大量的研究表明，lncRNA数量庞大，且调控的方式多种多样，它通过与DNA、RNA、蛋白质的相互作用，在生命活动调控网络中扮演着十分重要的角色。目前对lncRNA的致病机制还知之甚少，但大量临床观察和实验证据显示，lncRNA可能通过转录前或转录后水平调控编码蛋白基因的表达，从而参与物种进化、胚胎发育、干细胞的维持、细胞的增殖分化以及肿瘤的发生等多种重要的调控过程。肺癌的发病率和死亡率在世界许多国家均居各种恶性肿瘤的首位，严重危害人们的健康和生命。目前，肺癌的诊断主要通过传统的痰细胞学、影像学等诊断技术，它们在肺癌的诊断方面缺乏特异性，与其它肺部疾病，如肺炎，肺结核等难以鉴别。因此发现新的、适用于高危人群筛查，具有较高特异性和灵敏性的诊断方法是提高肺癌患者生存率的重要途径。随着肿瘤分子生物学研究的发展，使从分子水平上诊断肺癌成为可能。现有的研究表明，lncRNA在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用，lncRNA的异常表达存在于很多肿瘤的发生发展过程中，如研究发现MALAT-1在非小细胞肺癌中呈过表达、PCGEM1在前列腺癌细胞中过量表达等。然而，目前对于lncRNA是否参与了肺癌的发生发展过程及其作用机制仍然不清楚。因此，探讨肺癌发生发展过程中lncRNA的表达谱变化，发现可能的特异性肺癌相关lncRNA分子标记物，对于肺癌的早期诊断具有重要的意义。基于lncRNA可能在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，本研究以乌拉坦诱导的BALB/c小鼠肺癌模型为基础，研究肺癌发生发展过程中lncRNA表达改变的情况，发现可能的特异性肺癌相关lncRNA分子标记物，为lncRNA参与化学致癌机制提供了一定实验证据。
　　方法：
　　1.建立小鼠肺癌模型以1000mg/kg的剂量在小鼠右下腹腔内注射乌拉坦（溶于200μl PBS磷酸盐缓冲液中），每周注射一次，连续四次；对照组每只小鼠在右下腹腔内注射100μl PBS磷酸盐缓冲液，每周注射一次，连续四次。分批将乌拉坦染毒后3个月的小鼠和6个月的小鼠处死，取出肺组织及肿瘤组织。
　　2.组织的病理分析制作对照组肺组织及乌拉坦处理组的肺肿瘤的病理切片，HE染色后，显微镜下观察组织病理改变情况。
　　3.表达谱芯片检测采用Invitrogen公司的Mouse Non-coding RNA Microarray（包含10802个小鼠lncRNA分子，25179个小鼠mRNA分子）分别对乌拉坦染毒后6个月的小鼠肺肿瘤组织、癌旁组织及对照组肺组织进行基因表达谱分析。
　　4.差异表达谱的分析分析表达谱中差异表达的lncRNA基因，筛选出表达倍数大于5倍的lncRNA。
　　5. qRT-PCR验证芯片结果取肺肿瘤组织与正常肺组织各三个生物学重复样，用qRT-PCR定量检测lncRNA表达改变是否与芯片结果相一致。
　　6. qRT-PCR检测lncRNA表达水平采用SYBR Green染料法分别对乌拉坦染毒后3个月及6个月的小鼠正常肺组织、肺肿瘤组织和癌旁组织进行qRT-PCR定量检测目的基因的表达水平。
　　7.统计分析采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。各实验组数据均以x±s表示，试验数据均重复3次。满足正态分布且方差齐同的两组间 lncRNA表达差异的比较，采用两组独立样本的t检验，不满足正态分布时采用非参数检验。所有检验均以双侧P﹤0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.动物模型结果对照组小鼠均没有发现肺肿瘤，乌拉坦染毒后3个月的小鼠肺肿瘤的发生率为85％，每只小鼠平均肿瘤数为2.81±2.04，肿瘤的平均大小为0.68±0.20；乌拉坦染毒后6个月的小鼠肺肿瘤的发生率为100%，每只小鼠平均肿瘤数为6.00±2.07，肿瘤的平均大小为1.76±1.34。
　　2.组织病理切片结果对照组小鼠肺组织切片无明显的增生性或肿瘤性病变，实验组小鼠肺肿瘤具有一致的外观形态，肿瘤组织切片可见腺癌结节，均为腺癌。
　　3. lncRNA芯片表达谱结果在肺肿瘤组织中lncRNA均上调或下调表达倍数在5倍以上且三次生物学重复 P<0.01的lncRNA有42个，其中上调表达的lncRNA有14个，下调表达的lncRNA有28个。
　　4. qRT-PCR验证芯片结果 qRT-PCR定量检测 AF498294、AK017233和AK017306的表达改变情况与芯片结果相一致。
　　5. qRT-PCR检测lncRNA表达水平结果乌拉坦染毒后3个月和6个月的小鼠肺肿瘤组织中AF498294均是上调表达的，AK017233和AK017306均是下调表达；乌拉坦染毒后6个月的小鼠肿瘤组织中的AF498294表达水平比乌拉坦染毒后3个月的小鼠肿瘤组织高；乌拉坦染毒后3个月和6个月的小鼠肺癌旁组织与对照组肺组织相比较，AF498294均是上调表达的。
　　结论：
　　1.经腹腔注射乌拉坦，可诱导BALB/c小鼠肺组织发生癌变，为本研究的后续工作建立了小鼠肺癌模型。
　　2.在乌拉坦诱导的小鼠肺癌组织中，lncRNA表达谱改变显著，提示lncRNA参与了小鼠肺癌的发生发展过程。
　　3.筛选出小鼠肺癌差异表达的lncRNA：AF498294、AK017233和AK017306；在小鼠肺癌发展过程中，不同时间点的肺肿瘤组织中这3个lncRNA均是差异表达，这提示它们可能是肺癌发展过程中的潜在分子标志物。

目录

封面

本课题受如下基金资助

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中文摘要

英文摘要

英文缩略词表

前 言

材料与方法

一、 材料

二、 方 法

结 果

一、 不同时间乌拉坦诱发肺肿瘤观察结果

二、 RNA提取及质量鉴定结果

三、 lncRNA芯片表达谱结果

四、 qRT-PCR验证芯片结果

五、 qRT-PCR检测3个lncRNA表达水平

讨 论

结 论

参考文献

综 述

在校期间完成与发表的论文

致谢

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