慢病毒介导的RNA干扰沉默HMGA2对HL-60细胞增殖及CCNB2、CCNA2表达的影响

摘要

急性髓系白血病(AML)是一类涉及多种形式染色体改变和基因突变的异质性恶性肿瘤，克隆性增殖是白血病患者产生异常造血和器官浸润的必要因素，但目前关于导致白血病细胞恶性增殖的中间步骤还不完全清楚。最近研究发现一种高迁移率族蛋白，高迁移率族蛋白组 A2（high mobility group A2，HMGA2），广泛参与包括白血病在内的人类多种肿瘤的发生，目前已有文献报道在白血病细胞中HMGA2的mRNA和蛋白质水平的表达都明显增高，但是还不了解HMGA2在白血病发生发展过程中所起的作用。探索HMGA2所调节的信号分子及在白血病发生发展过程中所起的作用对了解白血病发生的机制是十分重要的，可进一步发现抗肿瘤药物的相关靶蛋白，对白血病的靶向治疗可能具有一定的意义。
　　人类HMGA2基因(过去又被称为HMGI-C基因),是高迁移率蛋白(high mobility group，HMG)家族成员，因其成员分子量较小，可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而得名，位于人类12号染色体的q15区，由5个外显子和4个内含子组成，其中外显子1-3编码3个DNA结合区域，外显子4编码DNA结合区域和酸性羧基末端之间的间隔区，外显子5则编码酸性羧基末端。
　　HMGA2蛋白是一种非组蛋白核染色质结合蛋白。一般位于细胞核内，由109个氨基酸残基组成，其蛋白氦基端含有3个短的基础重复序列编码结构域，能与DNA分子小沟内的AT丰富区结合，称之为AT-hooks结构。HMGA2自身没有激活或抑制转录的活性，但可作为构筑因子，通过AT-hooks结构与DNA结合并改变染色质空间结构，通过复杂的蛋白-DNA、蛋白-蛋白相互作用网络，统筹核蛋白复合物的装配，从而正向或负向调控靶基因的表达。
　　HMGA2蛋白在胚胎发育和细胞分化增殖中发挥着重要的作用，研究表明在胚胎发育早期除脑组织外几乎所有组织都大量表达HMGA2，而在成人组织、分化成熟组织中几乎检测不到其转录产物［1］。近年来，越来越多的研究报道发现，多数肿瘤［2-6］均存在HMGA2过度表达或表现出12号染色体易位导致的HMGA2基因重排的特征，表明HMGA2与肿瘤的发生发展有着密切的联系。然而HMGA2在血液系统肿瘤中研究较少，最初有学者利用常规RT-PCR方法在急、慢性髓系白血病患者的外周血、健康志愿者及上述患者的CD34阳性造血干细胞中检测到 HMGA2的表达，研究者认为HMGA2在白血病患者中的表达可能是由于异常造血干细胞增殖所致，并有可能成为检测某些类型白血病的敏感标志。此外，有研究报道在发生Richter转化的慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、原发性骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病等患者中利用FISH等检测到 HMGA2的染色体12q13-15区重排，且认为发生HMGA2重排的患者大多数预后不佳。
　　RNA干扰技术是通过双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)高效、特异的阻断生物体内特定基因的表达［7］，dsRNA与某些核蛋白形成RISC（RNA-induced silencing complex，RISC）复合体，与目的mRNA互补结合后，RISC能切割目的mRNA，促使 mRNA降解,阻断蛋白质的翻译，从而关闭该基因的功能。与传统的反义技术相比较,RNA干扰的作用更强大，能作为基因治疗的一种工具，在肿瘤、显性遗传疾病或感染性疾病中发挥着重要作用。RNA干扰技术为进一步揭示白血病的发病机制提供了有力的工具，基于RNA干扰技术的基因靶向药物治疗手段极具有应用前景。化学合成的siRNA在细胞内所起作用的时间较短，为了达到对靶基因持续抑制，Brummelkamp等［8］报道了细胞内合成的siRAN，一般是由启动子+siRAN相应序列+终止码组成，在细胞内转录后形成发夹状短链干扰 RNA（small hairpin RNA，shRNA）。其在细胞内能持续抑制靶基因的表达，且持续时间可达7天以上，并能显著降低制备 siRNA的成本。目前已有研究证实，21-ntsiRNA能够特异性抑制哺乳动物体内内源性基因的表达。以 DNA为基础的质粒载体将siRNAs导入到哺乳细胞内，但只是瞬时地表达siRNAs，不易得到稳定的转染效果。利用脂质体或物理方法如电穿孔直接将siRNAs导入细胞内，转染效率低下，可能会使细胞的活性丧失。相比较而言，病毒的感染效率高、激发细胞免疫反应的作用弱，是携带干扰 RNA的理想载体［9］。因为病毒载体能够有效地导入siRNA，并且趋向于提供更为稳定的基因表达抑制效应，尤其以慢病毒载体，它不仅可以稳定地表达 siRNA,而且还具极高的转染效率和较长时间的持续干扰效应。
　　本课题以人急性早幼粒白血病细胞为研究模型，利用细胞生物学和分子生物学及RNA干涉技术手段，研究了HMGA2与白血病细胞恶性克隆性增殖行为的关系，以揭示HMGA2在白血病发生发展过程中所起的作用，为寻找治疗的靶位点和白血病的基因治疗提供理论和实验依据。
　　本研究首先设计并合成含有干扰HMGA2的双链寡DNA片段及不针对任何mRNA的阴性对照序列DNA片段，与慢病毒载体质粒PGCSIL-PUR、PGCSIL-GFP重组形成 shRNA表达载体，经测序鉴定获得连接正确的克隆。在包膜载体 pHelper1.0和pHelper2.0的存在下，通过Lipofectamine TM2000共转染包装293T细胞获得携带HMGA2基因的RNAi慢病毒HMGA2-RNAi-LV,NC-GFP-LV），然后用重组的慢病毒感染HL-60细胞，以嘌呤霉素筛选获得稳定干扰HMGA2基因的细胞株。通过Real time-PCR和Western blotting检测转染后HL-60细胞中HMGA2的mRNA和蛋白表达的变化，CCK-8法检测细胞增殖抑制率，软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖能力，FCM检测细胞周期。RT-PCR及Western blot检测cyclin B2，cyclin A2在mRNA、蛋白水平的表达。
　　本实验的主要结果和结论如下：
　　1.成功构建了人源HMGA2 siRNA真核表达的重组载体，所构建的载体经琼脂糖凝胶电泳、DNA测序证实是正确的。在包膜载体 pHelper1.0和pHelper2.0的存在下，通过Lipofectamine TM2000共转染包装293T细胞获得携带HMGA2基因的RNAi慢病毒HMGA2-RNAi-LV,NC-GFP-LV），然后用重组的慢病毒以MIO为200的感染指数感染HL-60细胞，48h后以10ug/ml嘌呤霉素筛选出了稳定表达HMGA2 siRNA细胞株，分别命名为：(1)LV-HMGA2shRNA、(2)LV-HMGA2shRNA、(3)LV-HMGA2shRNA和LV-non-specific construct，经Western-blot检测和RT-PCR分析显示，与正常的HL-60细胞和阴性对照组重组病毒感染的HL-60细胞相比，感染重组LV-HMGA2shRNA病毒在蛋白和mRNA水平显著地抑制了HMGA2的表达。结果表明：本实验成功构建了人源HMGA2 siRNA真核表达的重组载体并制备出了重组慢病毒，成功筛选出了稳定敲低 HMGA2表达的细胞系，从而为进一步研究 HMGA2在白血病发生发展中所起的作用奠定了基础。
　　2.报告基因分析显示,稳定敲低HMGA2并没有影响报告基因LamininA/C的表达,这说明，敲低HMGA2的表达后在本实验中没有产生影响报告基因表达的非特异性反应,慢病毒介导的RNA干扰效应是能够特异性地抑制内源性HMGA2的表达。
　　3.HMGA2的高表达显著地增加了白血病细胞增殖的能力。本实验采用CCK-8细胞增殖实验分析研究了HMGA2对HL-60细胞体外增殖能力的影响。结果显示，重组的LV-HMGA2shRNA病毒导入的HL-60细胞增殖率显著下降。与HL-60细胞和non-specific construct的重组病毒导入的HL-60细胞相比,转染HMGA2-RNAi-LV组细胞的增殖速度明显减慢，24h即开始分离，转染HMGA2-RNAi-LV组曲线低平，差异有统计学意义（F=17.982，P=0.00）,HMGA2表达抑制后细胞增殖受抑制。结果提示HMGA2的高表达显著地促进了白血病细胞增殖作用。
　　4. HMGA2的高表达显著地增加了白血病细胞克隆形成的能力。软琼脂克隆形成实验显示与阴性对照组和空白组细胞相比，来自(1)和(3)的HL-60细胞在体外经长期培养后只能形成较少的克隆，且克隆也较小，其克隆形成率分别为（42.7±2.8）％、（37.2±4.1）%；而阴性对照组克隆形成率为（70.9±1.8）%、空白组为（73.5±2.1）%；实验组克隆形成率较阴性对照组和空白组明显减少，有显著性差异（F=20.227，P＜0.001)。
　　5. LV-HMGA2 shRNA对HL-60细胞周期的影响。在来自(1)和(3)的HL-60细胞实验组中G2/M期的细胞明显上升，其百分率分别增加到(27.2±3.81)％、(30.1±5.78)％，与阴性对照组细胞、空白组细胞相比较有显著差异（P<0.05，n=3），结果表明HMGA2基因表达沉默后对HL-60细胞G2/ M期有阻滞作用。干扰HMGA2表达后的细胞内cyclin B2的mRNA和蛋白的相对表达含量，与对照组相比较，明显下降，转染shRNA1组和shRNA3组的mRNA抑制率分别为（57.31±7.11）%和（67.55±7.69）%，蛋白表达抑制率分别为（51.77±4.81）%和（55.29±3.99）%，P<0.01。而cyclin A2的mRNA和蛋白表达量在各组之间比较无明显差异。
　　综上所述，慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。本课题成功构建了能高效抑制白血病细胞中 HMGA2表达的shRNA重组慢病毒，为进一步研究人白血病细胞恶性增殖的机制及HMGA2所介导的信号通路可能成为肿瘤基因治疗的靶通路提供了理论和实验依据。

目录

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前言

本课题的立论依据

第一部分高迁移率族蛋白组A2 siRNA真核表达重组载体的构建、鉴定及重组慢病毒的制备

（一）研究方法

1. 人HMGA2基因shRNA模板序列的设计

2. 慢病毒载体系统

3. 用pGCSIL-PUR、pGCSIL-GFP分别构建HMGA2-siRNA，NC-siRNA慢病毒载体

4.慢病毒的包装和慢病毒滴度测定：

（二）结果

1.携带目的基因慢病毒质粒的鉴定

2. 包装过程中293T细胞的变化

3. 采用逐孔稀释法测得的病毒滴度分别为：

讨论

结论

第二部分慢病毒介导的shRNA对急性髓系白血病HL-60细胞中HMGA2表达和细胞生长的抑制作用

（一）研究方法

1.细胞培养：

2. NC-GFP-LV慢病毒对HL-60细胞感染效率的监测

3. HMGA2-RNAi-LV慢病毒感染HL-60细胞阳性克隆的筛选

4. 慢病毒感染后HL-60细胞中HMGA2、CCNB2及CCNA2表达的变化

5. 慢病毒感染后HL-60细胞生长曲线、克隆形成能力及周期重新分布的变化

6. 统计学处理：

（二）结果

1.NC-GFP-LV慢病毒对HL-60细胞感染效率：

2. HMGA2-RNAi-LV慢病毒感染HL-60细胞阳性克隆的筛选

3.慢病毒感染后白血病细胞HL-60细胞中HMGA2表达的变化

4.慢病毒感染后HL-60细胞生长曲线、克隆形成能力及周期重新分布的变化

5.特异性shRNA干扰对cyclinB2、cyclinA2表达的影响：

讨论

全 文 小 结：

参考文献

附图

综 述

中英文缩略词表

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