BmKpp对小鼠骨髓造血细胞的辐射保护作用

摘要

背景和目的：
　　放射治疗在临床上是治疗肿瘤的有效手段之一，由于机体对电离辐射的敏感性和耐受性不同，对电离辐射极敏感的胃肠道及骨髓造血系统常受累及，引起急性辐射综合征以及骨髓造血系统的长期损伤，使患者的造血重建障碍，影响其长期的生活质量。临床使用人重组细胞因子用以治疗急性辐射综合征，可恢复辐射后早期的外周血细胞，但由于其促进造血干细胞的增殖影响自我更新功能，加重长期骨髓抑制。寻找一种保护辐射后骨髓造血细胞，维持其长期的造血功能是亟待解决的问题。前期研究表明，蝎毒多肽可促进放疗后骨髓抑制的小鼠造血细胞和免疫细胞数量的恢复，可促进CFU-mix的形成，其作用机制可能与激活JAK-STAT信号转导途径有关。蝎毒促增殖肽（Buthus Martensii Karsch polypeptide，BmKpp）是本课题组分离的，具有自主知识产权的新的纯化多肽，它是α蝎毒素，它对钠离子通道的失活和激活状态具有调节作用。本研究在前期工作基础上，观察 BmKpp对辐射后小鼠骨髓造血细胞的影响，并探讨BmKpp可能的作用机制。
　　材料与方法：
　　1.蝎毒多肽成分筛选：取 C57BL/6小鼠的骨髓有核细胞（BMNC），经过2Gy X射线照射后，分为6组：辐射组(IR+，生理盐水 NS）、IR++SVPⅡ1.0（1.0μg/ml）、IR++BmKⅣ0.5（0.5μg/ml）、IR++BmKⅣ1.0（1.0μg/ml）、IR++BmKpp0.5（0.5μg/ml）以及IR++BmKpp1.0（1.0μg/ml）（分组命名和药物使用剂量下同）。通过长期骨髓造血细胞液体培养（LTBMC）确定最有效的蝎毒多肽组分，并确定最佳使用浓度，作为体外实验中使用的浓度。
　　2. BMNC集落形成（CFU）实验：取2Gy X射线照射后的BMNC，进行半固体甲基纤维素培养观察CFU-mix形成。分为3组：IR+组（NS）、IR++BmKpp0.5、IR++BmKpp1.0，分别在7d、14d计数 CFUs，观察 BmKpp对辐射后 BMNC CFU-mix形成的影响。同时观察LTBMC液体培养14d时BMNC的形态。
　　3. LTBMC培养法。BMNC经过2Gy X辐射后分为4组：IR+（NS）、IR++CTX10.5（0.5μg/ml）、IR++BmKpp0.5、IR++BmKpp1.0，并以未经辐射的BMNC为空白对照组（IR-）。每周半量换液和加入相应半量药物，于7d、14d、21d、28d、35d、42d、48d、56d、63d、70d计数液体培养中的造血克隆数量。
　　4. CFU再种植实验。LTBMC培养14d和35d时，收集 IR+(NS）、IR++CTX10.5（0.5μg/ml）、IR++BmKpp1.0（1.0μg/ml）3组的克隆细胞核并消化贴壁细胞，再行半固体甲基纤维素培养35d，观察BmKpp对BMNC干性的影响。
　　5. BMNC内[Ca2+]i、[Na+]i的检测。①体外实验：BMNC经过2Gy X辐射后分为3组：IR+（NS）、IR++BmKpp0.5、IR++BmKpp1.0，并以未经辐射的BMNC为空白对照组（IR-，NS），IR-+ BmKpp0.5（0.5μg/ml）为空白给药组。培养7d、14d后，采用免疫荧光法，用激光共聚焦显微镜检测细胞内[Ca2+]i、[Na+]i的情况。②体内实验：将 C57BL/6小鼠随机分为4组：IR-组(NS）、IR-+BmKpp组（BmKpp1/40LD50）、IR+组（4Gy+NS）、IR++BmKpp组（4Gy+BmKpp1/40LD50），分别在3d、7d、14d、21d、28d通过流式细胞仪检测 BMNC内[Ca2+]i、[Na+]i荧光强度。
　　6.细胞活力检测：分为对照组（NS）、BmKpp0.5（0.5μg/ml）、BmKpp1.0（1.0μg/ml）3组，采用MTS方法，分别在24h、48h检测 P388、KG1a的细胞活力。
　　结果：
　　1. BmKpp（0.5μg/ml）在14d时集落数目较 IR+组显著增多（P<0.05），其他蝎毒多肽组分均与IR+相近，无统计学意义。故后续实验主要观察BmKpp的辐射保护作用。
　　2. BmKpp对集落生成的影响：辐射后 BMNC经 BmKpp处理后，计数7d时的CFU-mix，IR++BmKpp0.5（3.33±1.53），与 IR+（1.33±0.58）相比明显增多（P<0.05）；计数14d的CFU-mix，IR++BmKpp0.5（7.00±2.65），与 IR+（3.33±1.15）相比明显增多（P<0.05）。
　　3. BmKpp对辐射后小鼠LTBMC的影响：IR++BmKpp0.5在14d时造血克隆数量较其他辐射组增加，从35d到70d，造血克隆较其他各组显著增多（P<0.05），以56d增加尤为明显。IR++BmKpp1.0在14d、21d和56d时集落数量较 IR+增多，差别无统计学意义。倒置显微镜下观察 LTBMC培养14d后，可见 IR++BmKpp0.5处理后基质细胞增多、致密；LTBMC培养70d后，可见 IR++BmKpp0.5处理后，基质细胞致密，其上附着的造血克隆较其他组显著增多。
　　4. BmKpp对辐射后 BMNC干性的影响：再种植于半固体培养基35d后，LTBMC培养14d/35d时的各组除 IR++BmKpp0.5有2个集落，其余各组均无集落生成。
　　5. BmKpp对小鼠 BMNC内的[Ca2+]i的影响：①体外实验： IR-+BmKpp0.5于14d时与 IR-相比，无明显差别。辐射后7d时[Ca2+]i降低，14d时增高。与 IR-相比，IR++BmKpp0.5和IR++BmKpp1.0在辐射后7d和14d时显著上调细胞内[Ca2+]i。②体内实验：BmKpp处理3d和7d后对未辐射小鼠BMNC内[Ca2+]i无明显影响。辐射后3d时，小鼠 BMNC[Ca2+]i已上调，14d时[Ca2+]i显著增加（P<0.05），随后逐渐降低，在28d时低于 IR-（P<0.05）。IR++BmKpp可显著提高辐射后BMNC内[Ca2+]i，在7d、21d时与IR+相比，有统计学差异（P<0.05），直到28d时，降低至正常水平下。
　　6. BmKpp对小鼠 BMNC内的[Na+]i的影响：①体外实验：BmKpp0.5μg/ml处理7d时，小鼠BMNC[Na+]i明显增加。辐射导致细胞内钠离子浓度增加，在7d和14d时，IR+与 IR-相比[Na+]i明显增高（P<0.05）。与7d、14d时的IR+相比，IR++BmKpp0.5和IR++BmKpp1.0均显著增加[Na+]i，并较7d、14d的IR-显著增加（P<0.05）。②体内实验：与 IR-相比，IR-+BmKpp可显著增加7d时的[Na+]i（P<0.05）。辐射可使BMNC内[Na+]i在3d时显著上调（P<0.05），从14d往后，与IR-无明显差别。IR++BmKpp可显著增加7d时[Na+]i，与 IR-相比差异显著（P<0.05），从14d往后，与IR-无明显差别。
　　7. BmKpp对肿瘤细胞的活力检测结果显示：BmKpp作用于 P388细胞24h，细胞活力与对照组相比无明显差别； BmKpp0.5和BmKpp1.0作用于 KG1a24h后，细胞活力均较对照组降低（P<0.05），作用48h后则无明显差别。
　　结论：
　　1. BmKpp可促进辐射后小鼠骨髓有核细胞 CFU-mix的形成和长期液体培养中造血克隆的形成，并对再增殖造血细胞的干性具有保护作用。
　　2. BmKpp适度上调了辐射后小鼠骨髓造血细胞内钙离子浓度，而钠离子的变化不明显。BmKpp对辐射后小鼠骨髓有核细胞再增殖的促进作用以及其干性的保护作用可能与[Ca2+]i上调有关。
　　3. BmKpp有选择性保护辐射后小鼠骨髓有核细胞，对肿瘤细胞无明显作用。

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封面

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缩略词

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1. 材料

2 方法

结果

1.蝎毒多肽不同组分筛选

2 体外给药对辐射后的小鼠骨髓造血细胞集落形成的作用

3. BmKpp对辐射后小鼠BMNC内[Ca2+]i的影响

4 BmKpp对辐射后小鼠BMNC内[Na+]i的影响

5 BmKpp对肿瘤细胞的细胞活力的影响

讨论

结论

参考文献

钙离子参与细胞增殖的研究进展

致谢

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