呋喃妥因及其代谢物的残留检测分析研究

摘要

硝基呋喃类是人工合成的广谱抗生素，因抗菌效果好、价格低廉等优点，曾被普遍用于治疗动物中的某些细菌性感染疾病和作为饲料添加剂促进动物生长。它们在动物体内被迅速代谢，其主要代谢物在体内存留时间较长。研究表明硝基呋喃类及其代谢物具有潜在的致畸性和致突变性，许多国家畜牧业领域已禁止此类药物使用。但一些人在经济利益等驱使下，违法使用的现象仍有发生。为了控制兽药的残留，保障动物源性食品的安全，有必要建立一种快速、有效的分析方法对其残留进行检测。
　　呋喃妥因（NFT）常被作为饲料添加剂来促进动物的生长，在动物体内代谢迅速，半衰期短，代谢物1-氨基乙内酰脲（AHD）与组织蛋白结合牢固，在体内存留时间长，因此，可以检测动物组织中的AHD残留来监测原药NFT的非法使用。本文以原药NFT及其代谢物AHD为研究对象，分别利用高效液相色谱（HPLC）方法以及间接竞争酶联免疫分析方法（ELISA）检测饲料中 NFT的残留以及动物组织中AHD的残留。主要研究结果如下：
　　①在传统方法的基础上，选择较简单的流动相乙腈-水，建立HPLC方法检测原药NFT的残留，并进行色谱条件优化和方法学验证。方法的检测限和定量限分别为0.02μg/mL和0.1μg/mL，NFT在饲料中的检测限和定量限分别为0.2mg/kg和0.7mg/kg。该结果低于农业部1486号公告的标准（检测限和定量限分别为0.3mg/kg和1.0mg/kg）。
　　②代谢物AHD与对羧基苯甲醛衍生制备半抗原1-(4-羧基苯亚甲基)-氨基乙内酰脲（CPAHD），经质谱、核磁和红外表征表明其制备成功。然后通过活化酯法和混合酸酐法制备了免疫原CPAHD-BSA(Z)和CPAHD-BSA(L)。通过紫外扫描表征并计算半抗原与载体蛋白的结合比分别为12.5和4.4。同时，利用家兔作为免疫动物制备多克隆抗体，经ELISA方法检测表明：免疫原CPAHD-BSA(Z)产生的抗体具有良好的灵敏性和特异性，进一步说明免疫原CPAHD-BSA(Z)制备成功。免疫原CPAHD-BSA(L)未表示出良好的效果，其可能原因在于偶联物中半抗原与载体蛋白的结合比较低，不能够刺激机体产生针对小分子的抗体。
　　③制备抗体的同时，对实验家兔生长性能和器官指数进行了跟踪测试，结果表明家兔的平均增重显著提高（p<0.05），同时心脏指数和肾脏指数显著提高（p<0.05），而对肝脏的影响不显著（p>0.05）。由此可以看出，在制备抗体的过程中提高了家兔的生长性能以及心脏和肾脏指数，对肝脏无明显影响。
　　④利用不同剂量的免疫原CPAHD-BSA(Z)和CPAHD-BSA(L)免疫小鼠制备多克隆抗体，通过ELISA方法，分别以CPAHD-OVA（Z）和CPAHD-OVA（W）作为包被原进行检测时，免疫原CPAHD-BSA(Z)产生的抗体具有较高的效价，其效价范围为1：32000～1：256000。与免疫原CPAHD-BSA(Z)相比，免疫原CPAHD-BSA(L)未显示出良好的效价。
　　⑤利用间接竞争ELISA方法检测动物组织中AHD的残留，首先对方法参数进行优化，选择灵敏度最高的抗体（6014）通过优化的方法进行检测。该方法具有良好的精密度，其 IC50值为4.93ng/mL，在猪肉组织和鸡肉组织中的检测限分别为0.17和0.16μg/kg。同时，抗体对1-(2-硝基苯亚甲基)-氨基乙内酰脲（NPAHD）具有良好的特异性，除了与半抗原CPAHD和原药NFT具有一定的交叉反应外，对其他竞争物几乎无交叉反应。在猪肉和鸡肉组织中添加AHD后检测，平均回收率范围为85%-90%，变异系数小于10%。并用HPLC方法对ELISA方法结果进行确证，二者表现出良好的相关性（R=0.998）。利用分子模拟方法研究抗体的亲和力与小分子结构的关系，对于检测组织中AHD的残留来说，半抗原中的C=N双键和苯环的存在对抗体的识别可能具有重要的作用。

目录

缩略词注释表

1 绪 论

1.1硝基呋喃类药物概述

1.2国内外相关法规

1.3原药NFT及其代谢物AHD

1.4研究的主要内容

2 原药NFT的检测分析

2.1引言

2.2仪器与试剂

2.3实验方法

2.4结果与讨论

2.5小结

3 代谢物AHD抗原的制备与表征

3.1引言

3.2仪器与试剂

3.3实验方法

3.4结果与讨论

3.5小结

4 家兔抗体制备过程中对动物生长性能和器官指数的影响

4.1引言

4.2仪器与试剂

4.3实验方法

4.4结果与讨论

4.5小结

5 小鼠多克隆抗体的制备与鉴定

5.1引言

5.2仪器与试剂

5.3实验方法

5.4结果与讨论

5.5小结

6代谢物AHD的残留检测分析

6.1引言

6.2仪器与试剂

6.3实验方法

6.4结果与讨论

6.5小结

7 结论与展望

7.1主要结论

7.2展望

致谢

参考文献

附录

A．作者在攻读学位期间发表的论文目录

B. 附图