重组人可溶性TRAIL的制备及其联合硼替佐米诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究

摘要

目的：人工合成人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)胞外功能区的基因序列,构建其重组原核表达质粒,优化蛋白表达和纯化的相关条件,制备具有生物活性的重组人可溶性TRAIL并研究其联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米(万珂)诱导肿瘤细胞凋亡的作用及其机制。
　　方法：通过PCR技术扩增TRAIL胞外功能区第114-281个氨基酸基因序列,利用基因重组技术构建原核表达质粒pET-28a(+)-TRAIL114-281。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α中,通过酶切鉴定筛选出阳性转化子并送上海英骏公司测序。从DH5α-pET-28a(+)-TRAIL114-281中提取出经测序验证过的重组质粒再转化大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达蛋白时调整诱导前菌群的密度(OD600值)、IPTG浓度、温度及诱导时间选择最佳诱导条件,同时对超声、渗透冲击和细胞裂解液三种破碎细菌方法做比较。并在低温诱导时,加IPTG诱导目的蛋白表达的同时加入了1mMZnSO4优化表达条件。亲和层析法纯化可溶性TRAIL蛋白后以不同浓度分别作用于H460细胞(对TRAIL敏感)和K562细胞(对TRAIL抵抗)24h,使用CCK-8法验证TRAIL是否具有抑制肿瘤细胞生长的生物活性。将制备的TRAIL单独或联合50nM硼替佐米应用于H460和K562细胞,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法检测caspase-8/-9/-3的活化程度,western blot分析细胞中Bax、Bcl-2、cFLIP蛋白的表达。流式细胞术检测50nM硼替佐米处理H460和K562细胞24h后DR4、DR5的表达量变化。
　　结果：
　　1.PCR扩增基因后经琼脂糖凝胶电泳分析,在DNA分子量标准500bp附近有一条明显的扩增条带,与TRAIL预期目的片段524bp大小一致,重组质粒pET-28a(+)-TRAIL114-281经双酶切并琼脂糖凝胶电泳分析,可见切下载体片段5344bp和目的片段524bp,这证实了TRAIL基因被成功扩增并正确连接至载体上。
　　2.将诱导蛋白表达产物的沉淀和上清进行SDS-PAGE分析,发现在蛋白分子量标准约为24KDa处沉淀和上清中均有明显蛋白条带,与预期的TRAIL蛋白分子量大小相符,证明了沉淀和上清中均有TRAIL蛋白表达,TRAIL蛋白诱导表达成功。
　　3.亲和层析法纯化可溶性蛋白后行SDS-PAGE分析,发现只在24KDa处有单一条带而无其他杂条带,说明TRAIL纯化效果良好。
　　4.0、50、100、200、400、800ng/mlTRAIL作用于细胞24h后CCK-8法检测其细胞活性,H460的细胞活性分别为100％,82.30±21.68%,78.73±19.12%,53.49±8.79%,47.42±7.34%,46.68±3.05%;K562的细胞活性分别为100%,87.12±6.12%,83.53±5.96%,78.54±1.34%,73.33±1.72%,58.29±1.94%,可见随着TRAIL浓度的升高,细胞活性逐渐下降。
　　5.0、50、100、200、400、800ng/mlTRAIL作用于细胞24h后,H460细胞的凋亡率分别为0.90±0.12%,34.65±5.13%,56.8±7.39%,58.58±7.03%,62.2±9.89%,63.1±8.47%,K562细胞的凋亡率分别为3.29±0.42%,4.07±1.38%,3.93±0.59%,4.52±1.84%,4.08±2.21%,4.61±0.94%,可见随着TRAIL浓度的升高,H460细胞凋亡率也逐渐升高。
　　6.经过不同处理,阴性对照(A组)、200ng/mlTRAIL(B组)、50nM硼替佐米(C组)、200ng/mlTRAIL+50nM硼替佐米(D组)分别作用于H460和K562细胞24h后,凋亡率分别为0.90.±0.12%,58.58±7.03%,13.68±5.92%,85.5±8.38%和3.29±0.42%,4.52±1.84%,3.94±1.47%,7.56±2.44%。经过以上不同处理后H460细胞caspase-8的活化程度分别为1,1.40±0.04,1.20±0.16,1.77±0.32;caspase-9的活化程度分别为1,1.50±0.25,1.45±0.17,2.36±0.20;caspase-3的活化程度分别为1,1.05±0.88,0.90±0.64,2.25±0.80。K562细胞的caspase-8的活化程度分别为1,1.79±0.59,1.24±0.13,1.72±0.87;caspase-9的活化程度分别为1,1.47±0.26,0.90±0.30,2.38±0.70;caspase-3的活化程度分别为1,1.57±0.06,0.99±0.33,1.96±0.41。联合用药后H460细胞的Bcl-2表达量由0.60±0.24减少至0.31±0.13,K562细胞的Bcl-2表达量由0.77±0.46减少至0.37±0.31,H460细胞的cFLIP表达量由0.95±0.4减少至0.47±0.21,K562细胞的cFLIP表达量由0.58±0.21减少至0.42±0.08。可见药物处理后细胞的caspase均被活化,Bcl-2和cFLIP蛋白表达量下降。
　　7.50nM硼替佐米处理后,H460细胞DR4表达量由4.19±1.85%上升至11.67±6.81%,DR5的表达量由96.99±1.64%上升至98.43±0.40%;K562细胞的DR4表达量由0.76±0.44%上升至1.70±0.46%,DR5表达量由20.90±16.97%上升至35.06±14.88%。
　　结论：
　　1.通过PCR、酶切、连接成功构建了重组表达质粒pET-28a(+)-TRAIL114-281。
　　2.通过条件的优化成功制备了具有诱导肿瘤细胞凋亡生物活性且性质稳定的重组人可溶性TRAIL。
　　3.TRAIL诱导H460细胞凋亡具有浓度依赖性,凋亡率随着TRAIL浓度升高而升高,但K562细胞凋亡率却并不随着TRAIL浓度的升高而明显升高。
　　4.药物处理后caspase-9的活化(尤其是联合用药组),说明了TRAIL联合硼替佐米诱导H460、K562凋亡启动了内源性凋亡途径。
　　5.硼替佐米能协同TRAIL诱导H460、K562细胞凋亡,其可能机制是上调死亡受体DR4、DR5的表达量和下调抗凋亡蛋白Bcl-2和cFLIP的表达量。

目录

封面

目录

缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前言

一、实验材料

1、实验所用细胞及菌株

2、主要试剂

3、主要溶液的配置

4、主要实验仪器

二、技术路线

三、实验方法

1、重组人TRAIL蛋白的制备

2、可溶性TRAIL联合硼替佐米的研究

四、实验结果

1.TRAIL蛋白的制备

2、可溶性TRAIL联合硼替佐米诱导凋亡的研究

讨论

总结

参考文献

附录1

附录2

附录3

附录4

综述

攻读学位期间发表的论文

致谢

声明