人3型腺病毒六邻体HVR1区的氨基酸修饰及其免疫特性的研究

摘要

目的:探讨人3型腺病毒（HAdV-3）六邻体HVR1区的氨基酸修饰及其免疫特性，为HAdV-3载体外源蛋白展示平台技术和基因疫苗的研究奠定基础。
　　方法:以pAdΔE3GFP为模板，搭桥PCR扩增HVR1区被修饰的六邻体片段（含ClaI，BamHI），克隆至穿梭质粒pBR322L/R载体上，与骨架质粒pAdΔE3GFP在大肠杆菌 BJ5183内同源重组后，经AsisI酶线性化，转染AD293细胞，拯救包装腺病毒。通过热稳定性实验检测重组腺病毒的热稳定性，生长动力学实验检测重组腺病毒的生长特性，免疫印迹（Western blot）技术检测外源表位在六邻体上的融合表达，ELISA分析六邻体HVR1区融合的外源表位与标签单抗和免疫血清的结合活性。
　　结果:PCR及核酸序列测定结果显示多肽flag、his6flag或 his6lgsflag成功插入至HVR1区；HVR1区可以插入长度至17个氨基酸的多肽表位而不影响病毒的热稳定性和生长动力学特性；多肽flag,his6flag或his6lgsflag在六邻体蛋白上得到表达并且暴露在病毒粒子表面；小鼠接种病毒rAd3/HVR1-flag,rAd3/HVR1-his6flag和rAd3/HVR1-his6lgsflag所产生的免疫血清可以分别与对应的GST-flag，GST-his6flag和GST-his6lgsflag中融合的表位相识别。但是，rAd3/HVR1-his6flag和rAd3/HVR1-his6lgsflag组免疫的血清不能识别 GST-flag和GST-his6融合蛋白。rAd3/HVR1-his6flag组免疫的血清主要是与GST-2（GST-HHHDYK）发生反应，与其它GST所融合的表位不发生反应；rAd3/HVR1-his6lgsflag组免疫的血清可以与GST-1（GST-HHHLGSDYK）,GST-3（GST-HHHHHHLGS）和GST-4（GST-LGSDYKDDD）发生反应，但是与GST-his6lgsflag（GST-HHHHHHLGSDYKDDDDK）中融合的表位结合效价最高。
　　结论:HAdV-3 HVR1区可以插入并展示17个氨基酸的外源线性表位，并在小鼠内诱导免疫反应。HVR1区融合的多个线性表位连接形成了一个新的表位并诱导小鼠产生针对该新表位的免疫反应，为在单一的HVR区插入多个表位形成多价疫苗载体的构建提供了参考作用。

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英文缩略词表

中文摘要

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前 言

材料与方法

1 材料

2 方法

结 果

1 重组腺病毒克隆载体的鉴定

2 重组腺病毒的包装

3 重组腺病毒六邻体结构的同源建模

4 重组腺病毒热稳定性的检测

5 重组腺病毒生长动力学的检测

6 重组腺病毒flag、his6 标签蛋白表达的鉴定

7 flag、his6标签蛋白暴露水平的检测

8 体液免疫反应

9 诱导表位的精确鉴定

讨 论

结 论

参考文献

综 述

附 录

致谢

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