吡格列酮抑制胶原诱导性关节炎大鼠炎症性骨吸收作用的研究

摘要

【研究背景和目的】
　　类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以外周关节慢性炎症及滑膜增生为主要表现,继而发展为关节软骨及软骨下的骨破坏的系统性自身免疫性疾病。RA的软骨和骨破坏造成的关节功能丧失不可逆转,给病人带来极大的痛苦。因此,阻止软骨及骨破坏在抗RA治疗中至关重要。胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)是现今国内外最为广泛接受的RA实验模型之一,两者具有许多相似的病理生理特点——肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)等炎症因子的明显增高,炎性细胞浸润,滑膜增生,软骨和骨破坏等。
　　OPG/RANKL/RANK是近几年来发现的在破骨细胞(osteoclast,OC)分化过程中的一个重要系统。核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)也被称为破骨细胞分化因子,其受体是位于OC前体细胞膜上的核因子-κB受体活化因子(Receptor activator for nuclear factor-κB,RANK);而骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)是RANKL的假受体,可与RANKL竞争性结合RANK。活化T细胞或滑膜成纤维细胞表达RANKL,与RANK结合,可促进OC前体细胞向OC分化和成熟,促进骨破坏与吸收。因此,RANKL可促进软骨及骨的破坏和吸收,OPG可拮抗RANKL的作用。另外,TNFα和RANK/RANKL都可通过直接或者间接作用于信号通路中的NF-κB,通过一系列反应最终介导破骨细胞分化,所以TNFα也是造成炎症性骨吸收的危险因子。本研究检测CIA大鼠的OPG、RANKL及TNFα的表达可准确地反映其骨代谢状况。
　　目前临床上的改善病情抗风湿药的疗效个体差异比较大,其所带来的感染、肝功能损害等副作用也较多。因此开发新的药物、新的作用靶点是势在必行的。本课题研究的吡格列酮是一种过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)激动剂,即临床上的噻唑烷二酮类(thiazolidinediones,TZDs)降糖药。长期以来,此类药物被认为是骨质疏松和骨折的危险因素,但近年来研究表明其不仅具有抗关节炎症作用,还具有抑制骨吸收作用[1,2],很有希望被应用于治疗炎症性骨吸收疾病,而对于治疗RA合并血糖升高及骨吸收的患者则更为合适。目前国内外报道已普遍认为其具有一定抗关节炎作用,而对于其是否具有抑制骨吸收作用有待进一步研究证实。
　　基于以上的研究背景,本研究的目的在于:一是建立类风湿关节炎大鼠模型——CIA,并动态观察CIA大鼠炎症发展,以及OPG、RANKL、TNFα的表达;二是验证PPAR-γ激动剂吡格列酮是否可抑制CIA大鼠的炎症性骨吸收,为进一步探讨其抑制炎症性骨吸收的作用机制做准备。
　　【内容和方法】
　　第一部分:CIA大鼠模型的建立及其血清、关节软骨和滑膜中OPG、RANKL及TNFα的表达
　　用牛Ⅱ型胶原和不完全弗式佐剂混合液注入大鼠皮下以诱导关节炎症。观察造模前后大鼠的活动、精神、饮食、关节红肿及大鼠后踝关节病理,每周记录大鼠的体重及后踝关节体积变化,并用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)法和免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)检测大鼠血清与关节滑膜中的TNFα蛋白的表达等以评估造模是否成功。用ELISA、IHC及免疫印迹(Western Blotting,WB)等方法检测并比较模型组和正常组大鼠血清、关节软骨及滑膜中的OPG的蛋白表达;用IHC法检测和比较模型组与正常组大鼠关节软骨中RANKL的蛋白表达。
　　第二部分:吡格列酮抑制CIA大鼠的炎症性骨吸收
　　按第一部分的造模方法建立CIA大鼠模型。随后分别用低、中、高剂量(3、10、30mg/kg/d)的吡格列酮混悬液灌胃,用TNFα拮抗剂(TNFα拮抗剂,注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白)腹腔注射治疗CIA大鼠3周。比较各治疗组与正常对照组、模型对照组的病理差异、骨代谢指标——OPG、RANKL及TNFα的蛋白水平差别。用ELISA法检测各组大鼠血清中OPG及TNFα的蛋白含量;用IHC法检测各组大鼠后踝关节软骨中OPG及RANKL、滑膜中TNFα的蛋白表达;用WB法检测各组大鼠后膝关节滑膜中OPG蛋白的表达。
　　【结果】
　　第一部分:CIA大鼠模型的建立及其血清、关节软骨和滑膜中OPG、RANKL及TNFα的表达
　　造模开始后,相比同期的正常组大鼠,CIA大鼠的进食、活动减少,精神下降,体重减轻,关节肿胀持续存在;CIA大鼠血清和关节滑膜中TNFα蛋白的表达明显增加(P<0.01),且滑膜中TNFα蛋白的表达随时间延长有持续增加趋势。CIA大鼠在造模后第14天,关节滑膜组织炎症、增生较明显,滑膜组织长入关节腔,但关节腔软骨未见破坏;由于炎症持续作用,造模后的第35天,滑膜组织侵入关节腔软骨,软骨不同程度破坏。正常组始终无关节滑膜组织增生、炎症,更无软骨和骨损害。相比正常组大鼠,CIA大鼠血清和后膝关节滑膜中OPG含量显著降低(P<0.01),并长时间维持在较低水平;CIA大鼠后踝关节软骨中RANKL蛋白的表达明显上调(P<0.01),并长时间维持在较高水平。
　　第二部分:吡格列酮抑制CIA大鼠的炎症性骨吸收
　　模型对照组后踝关节炎性细胞侵润、滑膜组织增生及软骨不同程度破坏;各治疗组关节炎症和滑膜增生不同程度改善,无软骨及骨破坏。相比模型对照组,各治疗组血清及软骨中OPG水平明显增高(P<0.05),而血清中TNFα及软骨中RANKL水平明显降低(P<0.05)。相比低剂量吡格列酮治疗组,高剂量吡格列酮治疗组大鼠关节软骨及滑膜中OPG水平明显升高(P<0.05),而TNFα及RANKL水平明显降低(P<0.05)。相比TNFα拮抗剂治疗组,高剂量吡格列酮治疗组后踝关节软骨中OPG水平较高(P<0.05),而RANKL水平较低(P<0.05)。
　　【结论】
　　1、成功建立了CIA大鼠模型,且CIA大鼠的关节炎症随时间延长有加重趋势。CIA大鼠中RANKL及TNFα的表达上调、OPG的表达下调可能共同导致了炎症性骨吸收。
　　2、吡格列酮可通过下调CIA大鼠关节软骨中的RANKL及血清中的TNFα,通过上调关节软骨、滑膜及血清中OPG的蛋白表达,起到一定的抑制CIA大鼠的炎症性骨吸收的作用。吡格列酮抑制CIA大鼠的炎症性骨吸收的作用具有随剂量增大而增强的趋势。

目录

中英文对照词汇

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英文摘要

前言

第一部分：CIA大鼠模型的建立及其血清、关节软骨和滑膜中OPG、RANKL及TNFα的表达

1 材料与试剂

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 主要配方

2 实验方法

2.1 技术路线

2.2 实验动物及分组

2.3 造模及评估

2.4 取材

2.5 大鼠后踝关节石蜡切片及HE染色

2.8 Western Blotting法检测大鼠后膝关节滑膜中OPG的蛋白表达

2.9 数据分析

3 实验结果

3.1 造模对大鼠平均体重和后踝关节体积的影响

3.2 造模对大鼠后踝关节HE染色镜下病理的影响

3.3 造模对大鼠血清中TNFα和OPG蛋白含量的影响

3.4 造模对大鼠后踝关节软骨中OPG及RANKL、滑膜中TNFα蛋白表达的影响

4 讨论

第二部分：吡格列酮抑制CIA大鼠的炎症性骨吸收

1材料与试剂

2 实验方法

2.1 技术路线

2.2 动物分组与治疗

2.3 造模及评估

2.4 取材

2.5 大鼠后踝关节石蜡切片及HE染色

2.6 ELISA法检测大鼠心脏血清中TNFα、OPG蛋白含量

2.7 免疫组化法检测大鼠后踝关节石蜡切片中 OPG、RANKL 及 TNFα 的蛋白表达

2.8 Western Blotting法检测大鼠后膝关节滑膜中OPG的蛋白表达

2.9 数据分析

3 实验结果

3.1 吡格列酮治疗加快CIA大鼠体重增长和减轻后踝关节肿胀

3.2 吡格列酮治疗可减轻CIA大鼠后踝关节炎症及软骨破坏

3.3 吡格列酮治疗降低CIA大鼠血清中TNFα且升高OPG的蛋白含量

3.4 吡格列酮治疗上调CIA大鼠后踝关节中OPG且下调RANKL及TNFα的蛋白表达

3.5 吡格列酮治疗上调CIA大鼠后膝关节滑膜中OPG的蛋白表达

4 讨论

全文结论

附图

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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