天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导A549细胞上皮间质转化过程以及对微小RNA表达的影响

摘要

研究背景与目的:
　　特发性肺纤维化(IPF)为原因不明并以普通型间质性肺炎(UIP)为特征性的病理改变的一种慢性纤维化性间质性肺疾病,预后不良,无有效治疗药物,其具体的发病机制尚未完全明确。肺泡上皮细胞-间充质细胞转分化(Epithelial-mesenchymal Transitionn,EMT)是肺间质纤维化发生发展的核心环节,是决定肺间质纤维化程度的关键因素。实验前期我们采用了肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)开展了天龙咳喘灵提取物干预肺泡上皮EMT的研究,结果证明:天龙咳喘灵提取物不仅能有效阻止甚至能够逆转肺泡上皮EMT。
　　microRNA(miRNA)是一类新近发现的长约22nt(核苷酸)的非编码小RNA分子,其广泛存在于真核生物体内,人类基因有近1/3受其调控。已有研究证明,部分miRNA参与了肺间质纤维化的发生发展,特定的miRNA有望成为肺间质纤维化治疗的新靶点。天龙咳喘灵是广东省名中医邱志楠教授的经验方,成方主要由熟附子、青天葵、法半夏、款冬花、五味子等十味中草药材组成。临床长期用于治疗喘息型慢性支气管炎、肺间质纤维化、哮喘等,疗效明确且无毒副反应。为此,我们进一步采用miRNA芯片技术,观察天龙咳喘灵提取物抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺泡上皮细胞EMT时miRNA表达谱的变化,为进一步研究miRNA在肺泡上皮细胞EMT中的生物学作用提供了实验依据。
　　研究内容和方法:
　　第一部分:天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT过程
　　1.采用MTT法检测天龙咳喘灵提取物对A549细胞增殖的影响,观察其剂量和时间的相互依赖性。
　　2.模拟体内炎症微环境,体外培养A549细胞,天龙咳喘灵提取物和/或TGF-β1刺激A549细胞后,应用相差显微镜观察A549细胞形态学变化。
　　3.RT-PCR、Western blot法检测EMT相关标记蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白水平的表达变化,研究天龙咳喘灵提取物对TGF-β1诱导的A549细胞EMT的影响。
　　第二部分:miRNA在天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT时的表达变化
　　1.体外培养A549细胞,天龙咳喘灵提取物和/或TGF-β1刺激A549细胞后,提取其总RNA,检测RNA的纯度和完整性。
　　2.应用miRNA芯片技术检测天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT过程miRNA表达的变化。
　　3.应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)验证芯片结果的可靠性。
　　结果:
　　第一部分:天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT过程
　　1.复方天龙咳喘灵提取物浓度在50μg/ml以上时,24h、48h、72h各时间点均呈现对A549细胞增殖的抑制效应。
　　2.TGF-β1与A549共培养48h后显微镜下观察,可见与对照组A549细胞比较,经TGF-β15ng/ml刺激后,大部分细胞呈现出梭状成纤维细胞形态,而在同时添加天龙咳喘灵提取物50μg/ml的A549细胞,上述梭状成纤维形态细胞较前明显较少,形态改变呈逆转趋势。
　　3.RT-PCR、Western blot结果显示TGF-β15ng/ml可以诱导EMT相关标记蛋白α-SMA表达的明显上调,而加入天龙咳喘灵提取物50μg/ml时可以明显抑制这种表达的上调。
　　第二部分:微小RNA(miRNA)在天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT时的表达变化
　　1.核酸检测仪检测3组样本总RNA的OD260/OD280值均在1.8-2.0之间,琼脂糖凝胶电泳可观察到18S与28SrRNA两条清晰条带,且亮度之比接近1:2。
　　2.芯片扫描获得诱导前后miRNA差异表达谱,采用custom error model(美国Illumina产品)进行差异基因分析,筛选出210个detection p-value≦0.05miRNA。分析样本间miRNA表达量的变化,识别出组间差异表达miRNA,提取数据进行归一化处理,筛选出2倍以上差异表达的miRNA共81个,其中与空白对照组比较,TGF-β1组有41种miRNA的表达出现显著改变,其中26种表达上调2倍以上,15种表达下调2倍以上;天龙咳喘灵提取物抑制组,有46种miRNA的表达出现显著变化,其中25种表达上调2倍以上,21种表达下调2倍以上;并且有17种miRNA表达在两组同时出现显著改变,其中在TGF-β1组明显上调而在天龙咳喘灵提取物抑制组明显下调13种,在TGF-β1组明显下调而在天龙咳喘灵提取物抑制组明显上调4种。其中包括mir-29a-3p、mir-29b-3p等在TGF-β1组下调而在天龙组上调;mir-139-3p在TGF-β1组上调而在天龙组下调。
　　3.为验证芯片表达谱结果的准确性,挑选miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-139-3p做荧光定量RT-PCR实验,检测结果为,和空白对照组比较:mir-29a-3p在TGF-β1组下调47.67％、天龙组上调79.19%;mir-29b-3p在TGF-β1组下调25.86%、天龙组上调150.69%;mir-139-3p在TGF-β1组上调74.17%、天龙组下调40.01%。结果基本与芯片表达谱结果一致。
　　结论:
　　1.复方天龙咳喘灵提取物能够抑制甚至逆转TGF-β1诱导的A549细胞EMT,EMT是纤维化发生发展的关键环节,提示其在抗纤维化药物治疗上的潜在应用价值。
　　2、miRNA表达的上调/下调与天龙咳喘灵抑制/逆转A549细胞EMT过程具有明显的相关性,而部分miRNA表达的上调/下调和肺纤维化的进程密切相关,为我们下一步研究miRNA在EMT过程中究竟发挥何种功能、具体调控机制如何奠定基础,开辟抗纤维化治疗的新思路。

目录

封面

目录

中英文对照词汇

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分：天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导A549细胞EMT过程

材料和方法

一、主要试剂与材料

二、主要仪器

三、主要试剂配方

结果

（一）MTT法检测天龙咳喘灵提取物对A549细胞增殖实验

（二）天龙咳喘灵提取物干预A549细胞EMT实验

讨论

第二部分：微小RNA（miRNA）在天龙咳喘灵提取物抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT时表达变化

材料与方法

一、主要试剂与材料

二、主要仪器

四、方法

结果

（一）提取总RNA，检测RNA的纯度和完整性

（一）miRNA芯片检测结果

讨论

全文结论

附图

参考文献

综述

致谢

声明