无基础疾病的肺隐球菌病患者细胞免疫功能变化及其机理探讨

摘要

研究背景及目的：
　　肺隐球菌病（Pulmonary Cryptococcosis PC）是由新型隐球菌感染引起的一种肺真菌病。新型隐球菌是一种条件致病菌，其孢子可随尘埃被吸入呼吸道内而引起呼吸道感染。PC是常见的机会性感染，特别是在免疫功能低下者，如AIDS、器官移植等患者。近年来，PC的病例报告有增加的趋势，也常见于无基础疾病及免疫缺陷的中年人。这类患者症状多不明显，常在体检中被发现，更易被漏诊、误诊，宿主免疫功能降低时易播散，甚至可引起严重的隐球菌性脑膜炎，治疗难度大，是世界范围内影响人类健康的疾病。
　　新型隐球菌的清除主要取决于宿主的免疫功能状态以及对感染所起的防御反应。宿主抵抗隐球菌感染主要通过IL-12/IFN-γ途径激活的Th1的保护性细胞免疫和巨噬细胞的吞噬清除。无基础疾病的人群，吸入新型隐球菌孢子后，宿主启动机体的免疫系统，调节机体对新型隐球菌的易感性和抵抗力以有效清除新型隐球菌。而对于AIDS患者，由于HIV感染导致宿主CD4+T淋巴细胞减少或缺乏，机体免疫功能抑制或低下，细胞免疫从Th1向Th2失衡，妨碍了隐球菌的清除，表现为患病。另一方面，新型隐球菌也能影响T淋巴细胞的活化、分化及存活，干扰Th1的分化和促进Th2的非保护性作用，从而影响机体的免疫功能。新型隐球菌感染宿主后，与宿主相互作用，改变其免疫状态，逃避宿主细胞免疫的清除作用，这可能解释新型隐球菌感染长期潜伏以及无基础疾病患者患病的原因。因此，研究无基础疾病的PC患者的细胞免疫功能变化，探讨其机理对PC的防治具有非常重要的意义。
　　本实验应用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）的方法来测定分析PC患者和健康对照组血清IL-12、IFN-γ和IL-4分泌水平的差异，为阐明无基础疾病的PC患者的细胞免疫功能变化提供线索。同时，通过观察IL-12对PC患者及健康对照组外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）IFN-γ和IL-4释放的影响，了解无基础疾病的PC患者IL-12/ IFN-γ等细胞因子的相互影响，初步探讨无基础疾病PC患者中新型隐球菌长期潜伏以及逃逸宿主细胞免疫的分子机制。
　　方法：
　　1、样本收集处理：收集无基础疾病PC的患者20例，健康对照组20例。抽取无菌肝素抗凝静脉血10ml，低速（2500rpm）离心分离血清，分装，低温（-80℃）保存。应用ELISA法检测IL-12、IFN-γ和IL-4。
　　2、PBMC分离培养及上清液细胞因子测定：低速离心（2500rpm）后，应用微量移液器将上层血清分装于1.5ml干净无菌EP管中，-80℃冰箱备用；下层细胞中加入适量淋巴细胞分离液，常规分离 PBMC，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1x10^6/ml,植入24孔培养板，在37℃，5%CO2培养箱箱孵育，按加入刺激物的不同分为两组：
　　RPMI1640空白对照组，rhIL-12(20 ng/ ml)组,终体积均为1ml,复孔对照。培养48h后，离心弃沉淀后收集上清液，于-80℃冰箱中保存备用。采用ELISA法测定IFN-γ、IL-4。
　　结果：
　　1、PC组血清IL-12、IFN-γ和IL-4浓度的变化：
　　PC组和健康对照组血清 IL-12、IFN-γ和IL-4浓度分别为（2.514±0.54pg/ml）vs（2.517±0.58pg/ml），（14.52±2.71pg/ml）vs（81.80±9.84pg/ml），（6.90±1.25pg/ml）vs（7.31±1.47pg/ml）。经检验，PC患者血清IFN-γ水平明显低于正常对照组(P<0.01)，而两组之间IL-12和IL-4的平均浓度无显著性差异（P>0.05）。
　　2、PC组PBMC上清液IFN-γ和IL-4浓度的变化：
　　PC组和健康对照组上清液在加入rhIL-12前IFN-γ和IL-4浓度分别为（55.69±13.61pg/ml） vs（51.13±17.54pg/ml），（5.056±0.6785pg/ml）vs（5.025±0.6403pg/ml），两组之间IFN-γ和IL-4的平均浓度无显著性差异（P>0.05）。
　　3、PC组细胞免疫功能的变化
　　PC组和健康对照组上清液IFN-γ、IL-4的平均浓度加入rhIL-12刺激后增加的倍数分别为：（4.3±0.5倍）vs（7.9±1.1倍），（0.86±0.43倍）vs（1.27±0.35倍）。经检验，PC组上清液IFN-γ平均浓度增长倍数明显低于健康对照组，差异有显著性（P<0.01），IL-4增长倍数的差异则无显著性（P>0.05）。
　　结论：
　　新型隐球菌感染导致无基础疾病的患者Th1细胞对IL-12的反应性和敏感性的下降，细胞免疫从Th1向Th2失衡，损害了患者的细胞免疫功能。这可能是解释无基础疾病的宿主新型隐球菌持续存在和患病的原因，也为IL-12用于PC患者的免疫治疗提供了理论依据。

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前 言

无基础疾病的肺隐球菌病患者细胞免疫功能变化及其机理探讨

材料

1、病例材料：

2、主要试剂及设备

方法

1、标本的收集及处理：

2、血清IL-12的测定：

3、血清IL-4的测定：

4、血清IFN-γ的测定：

5、PBMC的分离培养

6、上清液IFN-γ和IL-4的测定

7、统计学处理：

结果

1、PC组血清IL-12、IFN-γ和IL-4浓度的变化：

2、PC组PBMC上清液IFN-γ和IL-4浓度的变化：

3、PC组细胞免疫功能的变化

讨论

结论

附图

参考文献

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