藤黄酸药物联合的细胞毒性效应及其机制

摘要

背景与目的：
　　藤黄酸（Gambogic acid，GA）是天然存在于藤黄科植物藤黄树(Garcinia hanburyi Hook. f.)的干燥树脂。临床研究证明，它对乳腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胃癌均有一定疗效，而对正常造血系统和白细胞无影响。藤黄酸可以促进细胞凋亡、抑制血管生成、抑制端粒酶活性、抑制核膜孔蛋白表达、诱导细胞周期在G2/M期停滞，激活T淋巴细胞对肿瘤细胞凋亡的诱导，是一个多靶点抗肿瘤药物。实验室的前期结果发现藤黄酸能够抑制肿瘤细胞的蛋白酶体活性，本实验在前期结果的基础上进一步探讨藤黄酸联合不同药物对正常细胞和肿瘤细胞的细胞效应，为藤黄酸的临床应用提供试验依据。
　　方法与结果：
　　1、大鼠骨髓间充质干细胞(Rat mesenchymal stem cells，rMSCs)体外分离、培养、扩增和鉴定
　　SD乳鼠颈椎脱臼致死后，双侧股骨，暴露骨髓腔，用含血清的培养液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液到离心管中，低速离心，弃去上清，用含10％FBS的低糖DMEM培养液制成单细胞悬液后接种于T25培养瓶中。10天左右待细胞生长汇合，用胰酶消化后按1：3的比例进行传代。约3代后可得到比较纯净的间充质干细胞。为了检验间充质干细胞的多向分化潜能，按照文献所述[18]诱导成脂。选择P4-P10代rMSCs,接种于6孔细胞培养板,24小时后,在诱导组的完全培养液中加入下列诱导剂(1μM地塞米松、5μg/ml胰岛素、0.5 mM IBMX、50μM吲哚美辛)诱导10天后，在倒置显微镜下可见胞浆内含有数量不等、大小不一、强折光性脂滴的脂肪细胞，有的脂滴融合成较大的脂泡。
　　2、藤黄酸联合蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)的影响
　　选择大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象，按一定数量接种于96孔板中，24小时后待细胞单层融合，弃掉上清，加入含不同浓度的藤黄酸（0.25μM、、0.5μM、1μM），MG132（0.25μM、0.5μM、1μM）新鲜培养基，作用48小时。加入MTS(CellTiter96 AQ MTS Reagent Powder)试剂，每100μL体积内加入20μL，37度恒温培养箱中孵育1-3小时，用多功能酶标仪检查光密度值,并计算联合指数(Combination index,CI)。发现1μM藤黄酸与1μM MG132作联合可抑制rMSC50%细胞活性，并呈浓度依赖关系，二者联合指数CI<1,说明两药应用有协同作用。
　　3、藤黄酸联合蛋白酶体抑制剂MG262对人肝癌细胞的细胞（HepG2）影响
　　选择人肝癌细胞的细胞（HepG2）为研究对象，按一定数量接种于96孔板中，24小时后待细胞单层融合，弃掉上清，加入不同浓度的藤黄酸（0.25μM、、0.5μM），MG262（0.025μM、0.05μM、0.1μM、0.2μM），作用48小时。加入MTS试剂，每100μL体积内加入20μL，37度恒温培养箱中孵育1-3小时，用多功能酶标仪检查光密度值,并计算联合指数 CI。发现藤黄酸与 MG262联合作用可抑制HepG2细胞活性，并呈浓度依赖关系，二者联合指数CI<1,说明两药应用有协同作用。
　　4、藤黄酸联合蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)内泛素化蛋白质的影响
　　试验选择大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)，加入不同浓度的藤黄酸（0.25μM、0.5μM），并且与MG132（0.25μM、0.5μM）联合。作用12小时收集细胞，裂解细胞，抽提总蛋白进行Western blot蛋白测定。SDS-PAGE电泳根据论文所述方法，采用ECL-Plus测定试剂及Kodak公司生产的X光曝光成像系统对实验结果进行采集。结果Ub的聚集与不同浓度的藤黄酸作用呈浓度依赖关系，药物联合之后 Caspase9出现降解带。表明藤黄酸诱导细胞凋亡与蛋白酶体的关系有关，且可以激活Caspase9蛋白分子。
　　5、藤黄酸联合铜离子对人乳腺癌细胞MCF-7细胞的作用
　　采用人乳腺癌细胞系MCF-7细胞为试验对象，设立藤黄酸单独组（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM），Cu单独组（10μM、20μM、30μM），Cu20μM+藤黄酸（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM）联合组，加药48小时用Annexin V/FITC双染试剂盒标记，在37度培养箱中孵育15-30min，在荧光倒置显微镜下观察不同凋亡时期的细胞，随着浓度增加细胞出现变圆，联合组贴壁细胞大部分浮起，说明藤黄酸与铜联合能诱导肿瘤细胞死亡，呈浓度依赖关系。同样的条件下，用MTS法检测细胞生长抑制，结果发现藤黄酸和Cu联合能抑制细胞活力，呈浓度依赖关系，计算联合指数均<1,具有协同效应。
　　6、藤黄酸联合铜离子对人肝癌细胞SMMC-7721细胞作用
　　采用人肝癌细胞系SMMC-7721为试验对象，设立藤黄酸单独组（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM），Cu单独组（10μM、20μM、30μM），Cu20μM+藤黄酸（0.75μM、1μM、1.5μM、2μM）联合组，加药48小时用Annexin V/FITC双染试剂盒标记，在37度培养箱中孵育15-30min，在荧光倒置显微镜下观察不同凋亡时期的细胞，藤黄酸与铜联合能诱导肿瘤细胞死亡，呈浓度依赖关系。同样的条件下，用MTS法检测细胞生长抑制，结果发现1.5μM藤黄酸和20μMCu联合能抑制细胞50%活力，呈浓度依赖关系，计算联合指数具有协同效应。
　　7、藤黄酸联合铜离子对体内外蛋白酶体活性的影响
　　（1）藤黄酸联合铜离子对体外蛋白酶体活性的影响
　　采用培养的人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，种于60mm培养皿中，待将MCF-7细胞80%-90%融合时倒掉原培养基，裂解细胞抽提全蛋白，蛋白浓度测定同上，调至1.0μg将不同浓度的铜（10μM、20μM、30μM）和15μM的藤黄酸各5μL混于490μLPH值为7.4的HCl中置于37度恒温箱中反应6小时。在96孔板中加入10μL/10μg蛋白，每个样本设2个复孔。然后每孔分别加入180μL Tris-HCl（PH7.4）（含2μL LSUC-LLVY-AMC）和10μL已孵育好的药物。将96孔板置于37度恒温水浴箱孵育120min后用荧光分光光度计测定荧光值。低浓度药物作用下，酶活性基本无变化，仅在Cu1.0uM与GA0.75uM时酶活性略有下降。
　　（2）藤黄酸联合铜离子对体内蛋白酶体活性的影响
　　采用培养的人乳腺癌细胞 MCF-7为研究对象，种于60mm培养皿中，待MCF-7细胞80%-90%融合，加入不同浓度的药物置于37度恒温箱中反应6小时。将每孔蛋白收集起来，调至1.0μg，然后将96孔板每孔分别加入10μg蛋白、180μL Tris-HCl（PH7.4）（含2μL LSUC-LLVY-AMC）。将96孔板置于37度恒温水浴箱孵育120min后用荧光分光光度计测定荧光值。酶活性随药物浓度增加而逐渐下降，药物联合后酶活性下降程度相应增加。
　　（3）藤黄酸联合铜离子对内源性蛋白酶体底物的影响
　　在96孔板上每孔种800个细胞，每孔加入100ul含药培养基，并设立空白对照及溶剂对照组，置37℃，5%CO2培养箱培养6小时，然后直接加入Cell-based CT-like activity assay底物，作用15min后直接测定Luciferase活性。
　　结论：
　　1、藤黄酸联合蛋白酶体抑制剂对肿瘤细胞的杀伤作用强于正常细胞。
　　2、藤黄酸联合铜离子增强肿瘤细胞毒性效应。

目录

封面

中英文对照词表

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

一、细胞

二、实验材料

三、主要仪器

四、主要溶液配制

五、 细胞活力检测

六、细胞凋亡的形态学检测

七、蛋白免疫印迹检测法Western blot

八、蛋白酶体酶活性测定

结果

一、藤黄酸与MG132联合对rMSC细胞活力的影响

二、藤黄酸与MG262联合对HepG2细胞生长抑制作用

三、藤黄酸对大鼠骨髓间充质干细胞rMSC泛素化蛋白质的影响。

四、藤黄酸联合铜对人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性作用

五、藤黄酸与铜联合对人肝癌细胞SMMC-7721细胞的毒性作用

六、藤黄酸联合铜对MCF-7细胞蛋白酶体活性的影响

讨论

结论

参考文献

藤黄酸抗肿瘤的研究进展

致谢

声明

学位论文知识产权权属声明

关于学位论文使用授权的说明