藤黄酸通过ROS--p53信号通路诱导非小细胞肺癌细胞A549凋亡机制的研究

摘要

背景和目的：
　　中药藤黄取自藤黄科植物藤黄树分泌的干燥树脂，性寒，味酸、辛、涩，主治痈疽肿毒，顽癣恶疮。藤黄酸(gambogic acid，GA)是中药藤黄主要的抗肿瘤活性成份，现代中药学研究证实其具有广谱抗肿瘤活性，有效抑制包括肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌等肿瘤细胞的生长。GA通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制端粒酶活性、诱导细胞G2/M期阻滞、抑制核膜孔蛋白表达、抑制血管生成、激活T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞等途径发挥抗肿瘤活性，但GA抑制p53野生型非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制尚未完全阐明。
　　本研究以p53野生型非小细胞肺癌细胞株A549为研究模型，观察GA对细胞生长的抑制作用，分析GA干预对非小细胞肺癌细胞ROS含量、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,Δψm）、细胞凋亡率的影响，检测p53及其下游促凋亡靶基因Bax、Bik和PUMA表达的变化情况，探讨GA诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的分子机制。进一步应用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine，NAc）预处理A549细胞，分析清除内源性ROS对GA诱导A549细胞凋亡、表达p53及凋亡相关蛋白的影响;深入研究ROS在GA调控p53表达诱导A549细胞凋亡中的作用。
　　实验方法：
　　体外培养p53野生型非小细胞肺癌A549细胞，MTT法观察不同浓度GA干预细胞24、48和72h对其增殖的影响;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法分析GA干预A549细胞24h凋亡率的变化;DFCH-DA法分析GA干预A549细胞2h胞内ROS的含量;JC-1探针染色分析GA干预16h后A549细胞线粒体膜电位的变化;Westernblot实验分析GA干预对A549细胞表达p53及其下游靶基因Bax、 Bik和PUMA的影响，及抗凋亡蛋白Bcl-2、caspase级联反应蛋白表达的变化。
　　我们进一步应用抗氧化剂NAc预处理2h清除内源性ROS，分析GA对A549细胞凋亡率、p53及凋亡相关蛋白表达的影响。
　　结果：
　　GA呈剂量-时间依赖关系抑制A549细胞的增殖，不同浓度(0.5、1、2.5、5和10μM）GA干预24h，存活率分别为98.3％±4.8％、92.7％±4.0％、73.1％±5.2％、42.6％±3.7％和21.5％±3.8％;干预48h，存活率分别为96.2％±5.4％、84.5％±4.6％、62.6％±4.8％、21.8％±5.0％和12.7％±3.6％;干预72h，存活率分别为95.4％±6.1％、80.2％±5.7％、43.5％±4.3％、18.6％±4.8％和10.3％±2.9％。 AnnexinⅤ-FITC/PI双染结果显示，2.5、5和10μM GA干预A549细胞24h的凋亡率分别为22.4％±5.7％、40.0％±6.2％和66.6％±5.2％，剪切型凋亡标志蛋白caspase9、caspase3和PARP的表达随GA浓度增高而显著增加。GA干预2h，A549细胞ROS含量显著显著高于空白对照组。GA干预16h，GA实验组Δψm较空白对照组明显下降。GA干预24h，p53及其下游促凋亡靶基因Bax、Bik和PUMA的表达显著增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2与空白对照组相比明显下降。
　　同时发现，5mM NAc预处理A549细胞有效抑制GA(10μM)诱导细胞凋亡的作用效应;GA+NAc组细胞表达p53较空白对照组无差异，caspase3和PARP未被剪切激活。
　　结论：
　　GA具有诱导p53野生型非小细胞肺癌A549细胞凋亡的作用效应，其分子机制是通过增加胞内ROS含量，上调p53及其下游促凋亡靶基因Bax、Bik和PUMA的表达，进而引起Δψm下降和线粒体凋亡途径的激活诱导细胞凋亡。