RDP修饰的姜黄素长循环脂质体靶向脑胶质瘤递药系统的研究

摘要

恶性脑胶质瘤（malignant gliomas，MG）是成人中枢神经系统中最常见的癌症，也是原发性脑肿瘤中预后最差的肿瘤。MG手术难以完全切除，复发率较高，生存期短，预后差，对人类的健康构成了极大的威胁。正因如此，迫切需要研制出一种更加有效且副作用较小的治疗剂。而具有多功能和多目标特征的天然化合物或其衍生物具有被开发成癌症最佳药物的潜力。
　　近年来,姜黄素（curcumine）因其在高剂量下对人体无毒并具有广泛和确切的生物活性及药理作用而受到了广泛关注。研究表明，姜黄素具有抑制多种细胞系的致癌作用，其作为治疗胶质瘤的潜在抗癌剂具有较高的研究价值。但是，由于姜黄素的一些性质致使其生物利用度很低，药代动力学不足，其在治疗 MG方面的应用也受到一定的限制。
　　将化学治疗剂递送到实体瘤以及提高其生物利用度的有效方法一直是当前生物医学研究中的主要挑战。在最近几十年里，基于纳米载体和纳米技术在医学成像和靶向药物递送领域里的迅速发展。脂质体（liposome）作为一类药物递送系统在抗肿瘤药物的传递中具有很大的优势。此外，通过表面修饰亲水性分子如聚乙二醇（PEG），脂质体的循环时间会进一步增加，并能通过实体瘤的高通透性和滞留（EPR）效应被动靶向肿瘤细胞。
　　目前，虽然对靶向脂质体已经有了较为深入的研究，但针对脑靶向脂质体的研究很少。血脑屏障（BBB）使治疗药物无法进入中枢神经系统（CNS）。临床上，CNS药物递送失败主要是由于缺乏适当的靶向递药系统（TDDS）。狂犬病病毒具有高度的嗜神经性，而衍生自狂犬病病毒糖蛋白（RVG）的多肽（Rabies-derived peptide,RDP）作为药物递送至大脑的靶向配体的出现，已经显示出其有作为非侵入性地克服BBB，从而用于靶向治疗的潜力。
　　综合以上可以看出，开发安全有效并能靶向到达肿瘤部位的抗脑肿瘤制剂，采用主动靶向递药策略，对于治疗恶性脑胶质瘤具有重要意义。
　　课题研究目的在于，开发一种安全有效的靶向脑胶质瘤递药系统，采用RDP多肽主动脑靶向和长循环脂质体在肿瘤部位的EPR效应被动靶向治疗恶性胶质瘤。本文在第一章简要介绍了该研究的背景和意义，并重点综述了RDP脑靶向序列研究的进展。随后，在主体实验部分，主要研究内容包括三个相互关联的部分：
　　（1）RDP多肽修饰靶向姜黄素长循环脂质体(RDP-Lip/CUR)的制备与表征；
　　（2）RDP-Lip/CUR体外靶向性及药效评价；
　　（3）RDP-Lip/CUR体内靶向性及药效评价三个方面。具体研究内容及结果如下。
　　首先，采用固相合成法合成 RDP多肽并利用NHS-PEG2000-DSPE中活性基团NHS与RDP多肽N端游离氨基反应，合成靶向材料RDP-PEG2000-DSPE。通过HPLC监测连接反应进程，用MALDI-TOF-MS对其进行表征，结果表明靶向材料连接成功。继而采用薄膜分散法，通过设计优化工艺分别制备了非靶向姜黄素长循环脂质体（mPEG-Lip/CUR）和RDP修饰的靶向姜黄素长循环脂质体（RDP-Lip/CUR），其平均粒径分别为98.3nm和102.7，分散系数为0.205和0.239，Zeta电位分别为-32.5mV和-30.8mV，包封率为89.56％和88.72%。透射电镜和原子力显微镜观察RDP-Lip/CUR外观圆整，分散均匀。体外释放结果表明所制备的脂质体上是否修饰RDP多肽对CUR的释放没有影响。在4度放置1个月后，能维持较好的稳定性。
　　在成功合成了靶向药物之后，需要考察其细胞靶向性和体外抑瘤作用。我们选用神经细胞人脑胶质瘤U87细胞和非神经细胞人肺腺癌上皮细胞A549细胞，通过荧光显微镜观察U87和A549细胞对RDP-Lip/CUR及mPEG-Lip/CUR的摄取情况，结果表明在U87细胞中，RDP-Lip/CUR组的荧光强度明显强于mPEG-Lip/CUR组且与游离姜黄素（CUR）组接近，而在A549细胞中，RDP-Lip/CUR组的荧光强度与mPEG-Lip/CUR组无明显差别，同时荧光共定位实验结果表明RDP-Lip/CUR组相比mPEG-Lip/CUR组能更快的进入U87细胞核，这说明RDP-Lip/CUR具有同RDP相同的神经细胞靶向性。研究得出该过程主要由网格蛋白介导的内吞途径入胞，并具有时间、浓度和温度依赖性，可以被GABA配体抑制。通过细胞抑制实验（CCK8）分析空白脂质体材料的细胞毒性以及载药脂质体的体外抗肿瘤活性可知，RDP修饰的长循序空白脂质体细胞毒性较低；在神经细胞U87上，RDP-Lip/CUR（IC50=16）较于mPEG-Lip/CUR（IC50=30）的细胞毒性更高，且与CUR的细胞抑制效果接近。而RDP-Lip/CUR（IC50=32.5）和mPEG-Lip/CUR（IC50=36.8）在非神经细胞A549的细胞毒性区别不大。这些结果说明RDP-Lip/CUR具有良好的抗胶质瘤活性。通过流式细胞仪定量分析姜黄素脂质体诱导细胞凋亡和细胞周期分布的改变情况以及用Western Blot分析检测凋亡相关蛋白的表达变化结果可知，RDP-Lip/CUR能通过上调Bax、caspase-3促凋亡蛋白，下调Bcl-2抗凋亡蛋白的表达，诱导U87细胞凋亡并阻滞细胞周期于G2/M期，其药效与CUR接近(P>0.05)，与mPEG-Lip/CUR相比有显著性的提高（P<0.01），这充分表明RDP-Lip/CUR具有良好的体外抗脑胶质瘤作用。
　　最后，需要对RDP-Lip/CUR体内靶向性及药效进行评价。首先建立了良好的脑肿瘤药效模型。通过脑立体定位仪体外建立 U87裸鼠原位脑胶质瘤动物模型，模型成瘤率100%，术后2周内死亡率0%，平均生存期23日左右。接着以生理盐水作为实验对照组，考察并比较了CUR，mPEG-Lip/CUR和RDP-Lip/CUR的体内抗肿瘤药效。通过荧光成像系统进行离体器官的荧光分布观察可知，分别在荷瘤小鼠和正常小鼠通过尾静脉注射4h后，RDP-Lip/CUR可以大量入脑并通过肿瘤EPR效应富集于胶质瘤部位；mPEG-Lip/CUR只有少量入脑且肿瘤部位富集较少；而CUR在脑内未见分布，仅分布于胆囊处。说明RDP-Lip/CUR具有良好的脑胶质瘤靶向性和长循环效应。分组给药后，多方面的考察RDP靶向姜黄素脂质体抗脑胶质瘤药效情况，包括核磁共振（MRI）检测肿瘤大小，脑组织切片HE染色观察肿瘤恶性程度，TUNEL检测脑内胶质瘤凋亡情况，免疫组化检测肿瘤组织相关蛋白表达水平以及比较荷瘤小鼠的生存周期。MRI结果显示，相对于mPEG-Lip/CUR和CUR组，RDP-Lip/CUR组小鼠脑肿瘤抑瘤率明显增高；HE染色结果表明RDP-Lip/CUR组相对于其它组脑肿瘤恶性程度最低。免疫组化实验结果表明相对于生理盐水组、mPEG-Lip/CUR组和CUR组，RDP-Lip/CUR组的Bax和cleaved caspase3阳性细胞表达数量显著增多，而Bcl-2，Ki67阳性细胞表达数量显著降低；TUNEL实验也得出 mPEG-Lip/CUR组肿瘤细胞凋亡率最高，说明RDP-Lip/CUR促进脑肿瘤组织细胞凋亡作用最强。生存期实验结果显示，RDP-Lip/CUR组小鼠生存期中位数较其它三组均明显增加，为30天，相比生理盐水组的22天延长了约36%。以上结果表明RDP-Lip/CUR具有较好的体内抗胶质瘤药效。最后，病理切片、血液及血清生化指标考察的结果表明RDP-Lip/CUR体内安全性良好。
　　通过以上章节的步骤，本研究设计并制备了RDP多肽修饰的姜黄素长循环脂质体靶向递药系统，同时构建了可用于胶质瘤药效评价的良好体内模型。该系统借助RDP主动脑靶向和脂质体被动肿瘤靶向的递药策略，能有效提高脑肿瘤靶向性和抗胶质瘤疗效，并具有良好的体内安全性。我们认为，RDP-Lip/CUR在脑胶质瘤的综合治疗中可能具有很高的应用前景。

目录

1 绪 论

1.1 研究背景和意义

1.2 狂犬病病毒糖蛋白的脑靶向序列研究进展

1.3 研究内容

2 RDP修饰的靶向姜黄素长循环脂质体的制备及表征

2.1实验材料和仪器

2.2实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5小结

3 RDP修饰的靶向姜黄素长循环脂质体体外靶向性及药效评价

3.1实验材料和仪器

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

3.5小结

4 RDP修饰的靶向姜黄素长循环脂质体体内靶向性及药效评价

4.1实验材料和仪器

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4讨论

4.5小结

5 结论与展望

5.1结论与创新点

5.2展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读博士学位期间发表的论文目录