一种Pep-1肽修饰的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法

摘要

本发明一种Pep-1肽修饰的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法，该纳米给药系统是由以两亲性聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)嵌段共聚物为载体材料制备的聚合物纳米粒、包载于该聚合物纳米粒中的紫杉醇及聚合物纳米粒表面修饰配体Pep-1多肽构成。所述聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)嵌段共聚物是由马来酰亚胺聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)和单甲氧基聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)组成，采用Pep-1作为靶向功能分子，两亲性嵌段共聚物PEG-PLGA为载体材料，通过共价结合将Pep-1多肽修饰于载体材料上，再制备胶质瘤靶向聚合物纳米粒。能够主动靶向脑胶质瘤，提高抗肿瘤药物在脑胶质瘤部位的摄取与蓄积，提高脑胶质瘤治疗效果。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤靶向与缓释给药系统技术领域，涉及一种胶质瘤归巢肽修饰的靶向 纳米递释系统，具体涉及一种新型多肽修饰聚合物纳米粒载紫杉醇的脑胶质瘤靶向纳米 递释系统及其制备方法。

背景技术

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占所有原发性神经系统肿瘤的80％。 胶质瘤恶性程度高，预后非常差，治疗效果不理想，目前针对恶性肿瘤的治疗手段主要 有手术治疗、化学治疗、放射治疗等，其中化学治疗是临床中应用非常普遍的治疗方法， 但绝大部分化疗药物不仅会杀死肿瘤细胞，还会破坏正常组织与细胞，产生较为严重的 毒副作用。因此，利用聚合物纳米粒作为药物载体，是降低化疗药物毒副作用，提高药 物疗效的最为有效的手段之一。

研究表明，血脑屏障的存在对于维持脑内环境的稳定有着重要的作用。它是由紧密 连接的毛细血管内皮细胞、基底膜以及嵌入其中的周细胞、外围的星形胶质细胞共同组 成的一种屏障结构，这种结构严重阻碍了脑胶质瘤治疗药物向肿瘤部位的递送，包括98% 的小分子药物和100%的大分子药物。但是一些内源性的配体可通过结合特定受体，利用 受体介导的转运过程，跨过血脑屏障，到达脑内。所以，通过受体介导转运的纳米递药 系统为脑胶质瘤治疗提供了一条颇具潜力的途径。

Pep-1(CGEMGWVRC)是一段由噬菌体展示技术筛选出来的线性多肽。研究显示，Pep-1 可以透过BBB并特异性归巢于脑胶质瘤部位，在脑胶质瘤细胞表面白介素13α2受体 (IL-13Rα2)介导下内化而被胶质瘤细胞摄取。因此，以Pep-1肽作为脑胶质瘤靶向递药 系统的靶向功能多肽，具有非常大的应用潜力。

紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是临床上广泛应用抗肿瘤药物，研究结果显示，PTX在体 外对胶质瘤细胞具有很强的细胞毒性，但是临床试验发现其抗胶质瘤疗效却不明显。主 要是由于PTX在体内难以透过血脑屏障和胶质瘤屏障，对胶质瘤无选择性。另外PTX水溶 性差，临床上通过聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇以1:1的混合液溶解。但聚氧乙烯蓖麻油 可促进组胺释放，常引起严重的过敏反应和其他毒性反应。

发明内容

本发明目的是，鉴于目前紫杉醇制剂存在的缺陷，提供一种胶质瘤归巢肽介导的靶 向纳米递药系统及其制备方法，延长药物体内的循环时间，增加药物在脑胶质瘤部位的 蓄积，提高抗胶质瘤疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗增效目的。

本发明的目的还在于，针对胶质瘤靶向递药系统都存在功能单一的缺陷，以既能透 过血脑屏障又能特异性归巢于脑胶质瘤的Pep-1肽为靶向功能头基，构建脑胶质瘤主动 靶向递药系统，具体涉及一种新型多肽介导的胶质瘤靶向化疗药物递释系统及其制备方 法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：Pep-1肽修饰的脑胶质瘤靶向纳米给药系统, 是由以两亲性聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)嵌段共聚物为载体材料制备的聚合物纳米 粒、包载于该聚合物纳米粒中的紫杉醇及聚合物纳米粒表面修饰配体Pep-1多肽构成。 采用Pep-1多肽作为靶向头基，聚(乳酸-羟基乙酸)聚合物为载体材料，通过两亲性聚合 物连接Pep-1多肽构建脑胶质瘤靶向载体；所述的脑胶质瘤靶向载体再进一步包载紫杉 醇，制成脑胶质瘤靶向纳米递释系统。

所述聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)嵌段共聚物是由马来酰亚胺聚乙二醇-聚(乳酸- 羟基乙酸)(Male-PEG-PLGA)和单甲氧基聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)(MePEG-PLGA)组 成，上述单甲氧基聚乙二醇重均分子量为2000～7000，马来酰亚胺聚乙二醇重均分子量 为3000～5000，聚(乳酸-羟基乙酸)重均分子量为10000～40000。

所述Pep-1肽与马来酰亚胺聚乙二醇的摩尔比为1～10:1。

所述Pep-1肽的氨基酸序列为CGEMGWVRC。

Pep-1肽修饰的脑胶质瘤靶向纳米给药系统的制备方法，先将Pep-1肽与马来酰亚 胺聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)聚合物通过共价结合连接，再将连接反应后的材料与单 甲氧基聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)聚合物按照下述比例通过乳化/溶剂蒸发法或者溶 剂扩散法制备成聚合物纳米粒，并将紫杉醇包载于所述聚合物纳米粒中。

所述Pep-1肽与马来酰亚胺聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)共价结合方法包括以下步 骤：将Male-PEG-PLGA溶于适量二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加到适量磷酸盐缓冲液中 (pH:7.0～7.4)，再将Pep-1多肽溶解于该磷酸盐缓冲液中(pH:7.0～7.4)，搅拌，氮气 保护，反应8～16小时，反应后的溶液通过透析法除去未反应的多肽，即得 Pep(Acm)-PEG-PLGA；在透析后的溶液中加入适量醋酸，滴加适量碘的甲醇溶液，氮气 保护，反应0.5～2小时；将反应后的溶液透析，冻干，即得Pep-PEG-PLGA。

在合成配体Pep-1肽时，对其一端的半胱氨酸进行Acm保护(C(Acm)GEMGWVRC)，即合 成Pep-1(Acm)肽；利用活泼的Male-PEG-PLGA与Pep-1(Acm)肽片段上未保护半胱氨酸残 基上的巯基反应，形成化合物Pep(Acm)-PEG-PLGA，再经过脱Acm保护基团后得到 Pep-PEG-PLGA。材料具体合成步骤为：

(1)将Male-PEG-PLGA溶于适量二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加到适量磷酸盐缓冲液中 (pH:7.0～7.4)。

(2)将Pep-1多肽加入适量磷酸盐缓冲液中(pH:7.0～7.4)，滴加到步骤(1)中的溶 液中，搅拌，氮气保护，反应8～16小时，反应后的溶液装入透析袋中透析除去未反应 的多肽，即得Pep(Acm)-PEG-PLGA。

(3)在透析后的溶液中加入适量醋酸，滴加适量碘的甲醇溶液，氮气保护，反应 0.5～1小时，将反应后的溶液透析，冻干，即得Pep-PEG-PLGA。

本发明中，Male-PEG-PLGA与Pep-1多肽的摩尔比为1:1～10。

所述乳化/溶剂蒸发法包括以下步骤：将一定量Pep-PEG-PLGA、MePEG-PLGA和PTX 溶于适量乙酸乙酯中，加入适量0.2%～1.0%泊洛沙姆188水溶液，间断超声形成水包油 (O/W)乳剂，分散到适量0.2%～1.0%泊洛沙姆188水溶液，搅拌，40℃旋转蒸发除去乙 酸乙酯，过膜，即得靶向纳米粒。

所述溶剂扩散法包括以下步骤：将一定量Pep-PEG-PLGA、MePEG-PLGA和PTX溶于 适量丙酮中，滴加到适量0.2%～1.0%泊洛沙姆188水溶液中，搅拌，50℃旋转蒸发除去 丙酮，过膜，即得靶向纳米粒。

本发明中，紫杉醇与聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)聚合物纳米粒的质量比为1:10～ 20。

对本发明制备的用于治疗脑部肿瘤的靶向纳米递药系统进行了体内外评价：

对本发明制备的Pep-1修饰的PEG-PLGA紫杉醇靶向纳米粒进行了细胞毒性实验、 细胞摄取实验、体内靶向性研究，结果表明，经Pep-1修饰后，显著增加了PTX对C6 胶质瘤细胞的细胞毒性，增加C6细胞的摄取能力，并且体内靶向性研究结果证明提高 了纳米递药系统在脑内胶质瘤部位的蓄积，达到预期目的。而Pep-1肽目前主要只是用 作细胞穿膜肽。将PTX制备成肿瘤主动靶向给药系统后，不仅能大大提高PTX溶解性， 减少毒副作用，还可以增加PTX对肿瘤部位的选择性，明显提高PTX的抗肿瘤效果。采 用Pep-1肽功能化的聚乙二醇-聚(乳酸-羟基乙酸)(Pep-PEG-PLGA)和单甲氧基聚乙二 醇-聚(乳酸-羟基乙酸)(MePEG-PLGA)组成的两亲性嵌段共聚物为载体材料，分子量合适 且承载功能强，对胶质瘤靶向治疗的效果好——能够主动靶向脑胶质瘤，提高抗肿瘤药 物在脑胶质瘤部位的摄取与蓄积，实现药物跨过血脑屏障和肿瘤屏障向脑内的递释，提 高脑胶质瘤治疗效果。

1）细胞毒性实验

采用MTT法测定Taxol和包载紫杉醇的NP、Pep-NP对C6细胞的体外抑制情况，结果如 图5所示，Pep-1修饰的纳米粒显著增大了PTX对C6细胞的细胞毒作用。

2）细胞摄取

聚合物纳米粒通过香豆素-6荧光标记后考察载体系统的细胞定性摄取情况，结果 如图6所示，浓度为100、200和600μg/mL时，Pep-NP组荧光强度(图6中的B、D、F)明显 强于NP组(图6中的A、C、E)，说明Pep-1修饰增加了C6细胞对纳米粒的摄取。

3）体内靶向性评价，

原位胶质瘤小鼠分别尾静脉注射0.15mg/kg香豆素-6标记的NP和Pep-NP，1h后的脑 组织切片荧光结果显示(图7)，Pep-NP在脑部肿瘤部位的荧光强度明显强于NP组，该结 果表明Pep-1修饰后能增加递药系统在胶质瘤部位的主动靶向与蓄积。应用Pep-NP的比 应用NP的两组原位胶质瘤小鼠，前者抗肿瘤作用明显优于后者。

附图说明

图1为本发明所用载体材料核磁共振图谱，其中，图1A：Mal-PEG-PLGA，图1B： Pep-PEG-PLGA；

图2本发明所用Pep-1多肽的质谱图；

图3为本发明胶质瘤靶向给药系统电镜透射图，其中A：NP-PTX，B：Pep-NP-PTX；

图4为本发明中C6胶质瘤细胞存活率柱状图；

图5为本发明中C6胶质瘤细胞的摄取荧光图，其中，图A和图B浓度为100μg/mL， 图C和图D浓度为200μg/mL，图E和图F浓度为600μg/mL，图A、图C、图E是C6 胶质瘤细胞对NP的摄取情况，图B、图D、图FC6胶质瘤细胞是对Pep-NP的摄取情况；

图6为本发明中纳米粒在脑组织分布的荧光图，黄色虚线为正常脑组织与胶质瘤 部位的边界线，黄色箭头指向的一侧为胶质瘤部位。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，具体实施例是在本发明的优选条件 下进行。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商 业途径而得。

胶质瘤归巢肽介导的靶向纳米递药系统采用乳化/溶剂蒸发法制备的步骤：

将一定量Pep-PEG-PLGA、MePEG-PLGA和PTX溶于适量乙酸乙酯中，加入适量0.2%～ 1.0%泊洛沙姆188水溶液，间断超声形成水包油(O/W)乳剂，分散到适量0.2%～1.0%泊洛 沙姆188水溶液，搅拌，40℃旋转蒸发除去乙酸乙酯，过膜，即得纳米粒。

或采用溶剂扩散法制备纳米粒:将一定量Pep-PEG-PLGA、MePEG-PLGA和PTX溶于适量 丙酮中，滴加到适量0.2%～1.0%泊洛沙姆188水溶液中，搅拌，50℃旋转蒸发除去丙酮， 过膜，即得纳米粒。

实施例1：Pep-PEG-PLGA的合成

称取20mg Mal-PEG(3500)-PLGA(38000)，溶于2mL DMF中，滴加到8mL磷酸盐缓冲 液(pH:7.0)中，搅拌，形成纳米粒溶液。称取Pep-1(Acm)多肽，溶于2mL磷酸盐缓 冲液(pH:7.0)中，将多肽溶液滴加到纳米粒溶液中(Male与Pep-1(Acm)摩尔比为1﹕3)， 氮气保护，搅拌，反应12h。将反应后的纳米粒溶液透析，去除未反应的多肽。在透析 过后的纳米粒溶液中加入1mL醋酸，滴加适量碘的甲醇溶液，氮气保护，反应0.5小时。 将反应后的纳米粒溶液透析，冻干，即得Pep-PEG-PLGA。

实施例2：乳化/溶剂蒸发法

将1mg PTX与MePEG(2000)-PLGA(38000):Pep-PEG-PLGA(38000)=9﹕1加入到乙酸 乙酯中溶解，加入适量1%泊洛沙姆188水溶液，间断超声(200W,5min)形成水包油(O/W) 乳剂，分散到适量0.5%泊洛沙姆188水溶液，搅拌，40℃旋转蒸发除去乙酸乙酯，分别 用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，即得纳米粒。

纳米粒溶液外观澄清，有明显的蓝色乳光。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以 94.25nm为有效直径呈正态分布，多分散性为0.117。扫描电镜下观察该纳米粒具有规 整的球形外观，在溶液中分散良好，并具有较好的稳定性。纳米粒包封率为77.3%，载 药量为3.77%。

实施例3：溶剂扩散法

将1mg PTX与MePEG(2000)-PLGA(38000):Pep-PEG-PLGA(38000)=9﹕1加入到丙酮 中溶解，滴加到适量1%泊洛沙姆188水溶液中，搅拌，50℃旋转蒸发除去丙酮，分别用 0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，即得纳米粒。

纳米粒外观澄清，有明显的蓝色乳光。激光粒度分析表明，所得纳米粒子以106.45 nm为有效直径呈正态分布，多分散性为0.165。扫描电镜下观察该纳米粒具有规整的球 形外观，在溶液中分散良好，并具有较好的稳定性。纳米粒包封率为23.4%，载药量为 1.14%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。