氯化镉诱导恶性转化16HBE细胞不同阶段差异表达基因筛选的研究

摘要

1.目的：
　　镉(Cadmium，Cd)是一种毒性很强的重金属，是环境污染物和致癌物，人类可通过工业污染或受污染的食物和水源广泛接触到镉。镉及其化合物被机体吸收后，自然代谢缓慢，大量研究证实镉及其化合物可通过生物放大和生物累积作用，诱发人体多种组织器官损伤，甚至导致恶变。国际癌症研究机构（IARC）早在1993年就将其归类为第一类致癌物，但其致癌机制还不完全清楚。
　　癌变是一个复杂的多阶段的过程，内外环境因素的相互作用导致了多种基因的变化，这些基因的改变往往与环境致癌因素的长期累积性损伤作用和机体内遗传因素有关。近年来，有多项研究针对镉对机体毒作用和致癌性展开。镉致癌的机制和过程就成为了研究的重点和热点，有研究表明细胞基因表达的改变是镉对机体损伤、镉致癌的机制之一。为了更深入的探讨镉致癌的过程和机制，本课题对镉染毒不同阶段的细胞进行了实验和检测，分析其在镉染毒过程中的不同阶段基因表达的改变，从基因表达角度揭示镉致癌机制。
　　2.方法：
　　2.1细胞培养与传代镉恶性转化人支气管上皮模型已于前期研究建立并公开发表。将正常人支气管上皮细胞16HBE，氯化镉恶性转化第30代细胞及转化细胞接种裸鼠成瘤细胞从液氮罐中取出，置37℃、5％CO2饱和湿度环境中培养。隔日换液，当细胞长满瓶底时，制成浓度为1×106细胞悬液，备用。
　　2.2样本的准备、测序文库的构建按试剂盒要求提取样本的RNA，纯化和浓缩，得到mRNA。将mRNA打断成200bp左右的片段，以小片段mRNA为模板，用随机引物合成双链cDNA。将cDNA扩增，经过末端修，产物纯化后，在3’末端加上“A”碱基，适配子(adapter)连接，纯化后，产物扩增。
　　2.3进行高通量测序、对测序数据进行处理通过测序，得到原始数据(Raw reads),经质量控制，取出杂质数据得到校准数据（Clean reads）。对校准数据做质量评估，质量合格后才可进行下一步分析。
　　2.4测序数据的结果分析过滤后得到的Clean reads通过与参考序列进行比对，进行统计分析，对各组基因表达水平、差异表达基因进行分析，分析实验重复性。对差异表达基因进行GO功能分析和Pathway分析。
　　3.结果：
　　3.1从正常人支气管上皮细胞16HBE，氯化镉转化第30代细胞及转化细胞接种裸鼠成瘤细胞中提取的总 RNA在核算定量仪上进行检测，总 RNA浓度为2～3mg/ml,OD260nm/OD280nm值在1.9～2.0之间。总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外线下观察到28S和18S两条条带，28S的亮度约为18S的1.5～2倍，5S条带未见或隐约可见。结果表明提取的总RNA纯度较高，未降解。三个样本mRNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果显示均为一条 smear，主要集中在0.5-2.0 kb之间，完整性良好。
　　3.2三个样品原始数据的碱基含量及分布，由于受随机引物的偏好性影响，数据的前lO个碱基含量波动较大，之后的较好。三种细胞碱基质量均良好，校准读数占原始读数的98﹪以上，校准后的数据质量较好。
　　3.3对样品的校准数据与参考序列的比对，三个样品的一致率均在60％左右，表明从实验建库到测序等步骤质量均符合要求。样本序列测序饱和度良好，说明测序过程状态较好。对样品的测序随机性进行了评估，发现样品reads在参考基因上的分布较为均匀。
　　以正常16HBE细胞为对照组，Cdcl2诱导转化细胞的表达基因有1926个基因表达水平上调，有457个基因表达水平下调；Cdcl2诱导成瘤细胞则有842个基因表达水平上调，有122个基因表达水平下调。
　　通过GO功能分类注释得出，在细胞组成方面，细胞内受体、细胞器、细胞核、染色体和蛋白质复合体的功能；在分子功能方面，分子粘合物、蛋白结合物、核苷酸结合物、激酶活性和转移酶活性功能；在生物学过程中，细胞过程、组织或细胞生物成分转化、核分裂、姐妹染色单体分离和染色体分离等功能的基因差异表达情况，均随着镉诱导转化的程度而加深。
　　通过Pathway分析，可以看出相对于正常16HBE细胞，Cdcl2诱导转化细胞和Cdcl2诱导成瘤细胞在细胞周期、氧化磷酸化、肿瘤通路、小细胞肺癌和DNA复制等方面功能的基因有显著性改变。随着镉诱导转化的程度，至细胞周期、DNA复制和肿瘤形成通路这三项功能的基因差异表达程度逐渐加深。其中，肿瘤原癌基因CBL、MET的表达上调，细胞周期蛋白相关基因CCND1、CCNA2表达上调，螺旋体保存激酶CHUK、泛素蛋白连接酶同系物MDM2、、磷脂酶C PLCG1基因表达上调。
　　4.结论：
　　4.1成功构建了正常16HBE细胞、Cdcl2诱导转化细胞、Cdcl2诱导成瘤细胞的测序文库。通过高通量数字基因表达谱测序，得到了三个样本的表达谱数据，Cdcl2诱导转化细胞和Cdcl2诱导成瘤细胞差异表达基因的筛选提供了依据。
　　4.2对差异表达基因进行分析，了解在镉毒作用的不同阶段，基因差异表达量是随着染毒时间延长而增加的。GO功能分析，掌握两组样本细胞组成、分子功能、生物学过程方面有基因表达差异。Pathway分析得知，随着镉染毒时间延长，细胞周期、DNA复制和肿瘤形成通路这三项功能的基因差异表达程度逐渐加深。其中，肿瘤原癌基因CBL、MET的表达上调，细胞周期蛋白相关基因CCND1、CCNA2表达上调，螺旋体保存激酶CHUK、泛素蛋白连接酶同系物MDM2、、磷脂酶C PLCG1基因表达上调。

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中文摘要

英文摘要

1. 前 言

2. 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3. 结 果

3.1 细胞总RNA的定量、完整性鉴定及纯度分析

3.2 mRNA的纯化

3.3 表达谱测序原始数据质量控制

3.4 校准后数据的质量控制

3.5 基因表达水平分析

3.6差异基因表达谱分析(DEGs)

3.7 实验重复性检测

4. 讨 论

5. 结 论

参考文献

镉致癌机理的研究进展

致谢