CASP1介导的HO-1 C-端剪切体在自噬和凋亡中作用机制研究

摘要

背景: 皮肤直接与外界接触，易受环境中紫外线UV辐射等产生ROS (reactive oxygen species)，引起氧化应激（oxidative stress），炎症，诱发皮肤肿瘤。UV诱导皮肤细胞血红素氧合酶1(heme oxygenase1, HO-1，32kDa)表达， HO-1可降解血红素，具有抗炎，抗凋亡及参与代谢，保护细胞减少氧化损伤等作用。研究发现HO-1可促进肿瘤细胞增殖，抑制化学物质毒性或紫外线照射引发的细胞凋亡，在很多癌组织中HO-1呈高表达，特别在皮肤癌、甲状腺癌和口腔癌等，而且HO-1的高表达与疾病分期和病人预后不良有关。目前，HO-1在肿瘤中的作用是近年来的研究焦点。但最近研究让人们对其作用产生诸多争议。在一些肿瘤中HO-1具有增强细胞耐药性促生长作用，但在前列腺和乳腺癌又具有抑制增殖功能；在对慢性炎症在肥胖和糖尿病作用研究中发现HO-1敲除可抑制代谢炎症和降低胰岛素抗性作用，这与过去认为HO-1的抗炎作用相反。进一步研究发现HO-1可定位于不同细胞器中，如内质网、线粒体和细胞核，而该蛋白的 C 端存在具有多种剪切方式，可产生不同功能的剪切体（truncated form），如小鼠中发现的28kDa HO-1（C端52氨基酸残基缺失）与Nrf2结合，影响AP-1、NQO1和G6PDH等蛋白活性。因此HO-1不同亚细胞分布和蛋白剪切修饰等导致该蛋白生理功能上差异。那么在人体细胞中HO-1 的 C 端是否存在类似的剪切方式？本研究首次发现 UV 辐射下 caspase 1 （CASP1）对人HO-1的C端进行剪切，产生一种新型剪切体，26kDa truncated HO-1（命名为26tHO-1）。本论文将对CASP1对HO-1的剪切方式和26tHO-1入核参与自噬和凋亡调控的机制进行详细的阐述。 目的: ① 研究CASP1对HO-1的剪切加工方式 a) 对26tHO-1的产生方式进行预测；研究HO-1转录后修饰加工与26tHO-1的关系。 b) 通过对CASP1进行敲除，利用免疫共沉淀、构建HO-1突变体等实验方法，研究CASP1和HO-1之间的相互作用。 c) 构建A375 不同位点的HO-1-/-敲除细胞株，检测HO-1敲除位点的差异对内源性26tHO-1产生的影响。 ② 26tHO-1功能研究 a) UV 辐射引起细胞凋亡与 26tHO-1 蛋白条带的产生的关系，以及该条带在细胞中的分布。 b) 研究26tHO-1和细胞自噬和凋亡的关系。 c) 研究26tHO-1与核转录因子Bmal1作用，及在调控细胞自噬和凋亡的作用。 研究方法： 通过流式细胞术检测 UV 辐射对 HaCaT 细胞凋亡的影响； 通过 western blot和核质分离研究UV辐射引起26tHO-1的产生及核内的分布；通过构建HA-HO-1和HO-1-HA过表达载体, 研究HO-1的C端和N端的剪切方式；通过CRISPR/Cas9系统对CASP1和HO-1进行敲除，构建不同敲除位点的HO-1-/-敲除细胞株；构建HO-1的CASP1识别位点的突变体；免疫荧光检测HO-1、突变体HO-1和26tHO-1 在细胞中的分布情况；通过免疫共沉淀检测 HO-1 与 CASP1 以及 26tHO-1 与Bmal1的相互作用；通过构建A375过表达DsRed-LC3B-EGFP的稳定细胞系，检测26tHO-1过表达对细胞自噬的影响；通过RT-RCR检测基因的表达；CCK-8和结晶紫着色检测细胞增殖；肿瘤异种移植模型研究 26tHO-1 对黑色素瘤增殖的影响；通过免疫组化研究肿瘤组织中Bax的表达。 结果： ① UV辐射下CASP1对HO-1的C端进行剪切，产生26tHO-1，26tHO-1可不依赖UV辐射入核。 a) UV辐射可诱导26kDa HO-1的产生，与全长HO-1相比该条带主要在细胞核内分布。UV辐射可诱导全长HO-1入核，而对CASP1敲除可抑制UV辐射下的HO-1的入核现象。 b) 免疫共沉淀实验证实HO-1与CASP1的相互作用，HO-1的CASP1识别位点的突变体抑制26kDa HO-1的产生。HO-1的不同位点敲除构建的A375 HO-1-/-细胞株具有不同的细胞形态和生物学特性，并影响内源性 26tHO-1的产生。 ② 26tHO-1 具有促自噬和凋亡作用，证实 26tHO-1 在核内与转录因子 Bmal1 结合，调控基因表达。 a) 与全长HO-1相比，26tHO-1在促细胞自噬方面的效应更强。26tHO-1过表达可显著上调自噬相关基因Beclin-1、LC3B、Atg3、Atg5、Atg7和Atg14的表达（RNA和蛋白水平）。 b) 与全长HO-1相比，26tHO-1可显著影响细胞凋亡。26tHO-1过表达促剪切型caspase3和9的产生，在裸鼠成瘤实验中抑制肿瘤的生长，并上调凋亡分子Bax的表达。 c) 与野生型A375细胞相比，保留CASP1识别位点的A375 HO-1敲除细胞株HO-1-/-1#中可检测到26tHO-1，而未保留CASP1识别位点的A375 HO-1 敲除细胞株 HO-1-/-2#中未可检测到 26tHO-1。与 A375 HO-1-/-2#相比， A375 HO-1-/-1#细胞增殖能力显著降低，自噬相关基因的表达显著升高，同时在该细胞中检测到剪切型caspase 9产生。 d) 通过免疫共沉淀实验发现26tHO-1与核转录因子Bmal1的相互作用，同时发现与 HO-1 相比，26tHO-1 可促 Bmal1 入核。对 Bmal1 的干扰可抑制26tHO-1引起的自噬和凋亡相关分子的表达。 结论： UV辐射引起细胞凋亡，同时导致26tHO-1的产生，该蛋白的产生和UV激活的CASP1有关。CASP1与HO-1结合，对HO-1的C端进行剪切产生的26tHO-1入核，与核转录因子Bmal1结合，调控细胞自噬和凋亡。目前关于HO-1的研究多聚焦在32kDa HO-1上，但这些研究在阐明HO-1参与基因调控的功能和解释HO-1功能的多样性方面显得不足，该研究提供了一个全新的角度来研究HO-1，为研究HO-1在UV辐射在肿瘤的中作用奠定基础，同时为皮肤肿瘤和其他光损伤性皮肤疾病提供一定的临床应用证据。

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