镉恶性转化16HBE细胞中LncRNA的表达谱筛选及其对DNA修复基因的调控作用

摘要

1.背景:
　　镉(Cadmium,Cd)及其化合物作为一类工业毒物和环境污染物,随着工业生产的迅速发展,它对环境污染日益严重,并在职业和环境中长期存在。镉及其相关化合物可通过工业生产或污染水源和食物进入机体造成呼吸系统、肾和骨骼等损伤,甚至导致肿瘤。而且,镉已被国际癌症研究机构(IARC)列为第一类致癌物,但镉的分子致癌机制到目前仍不清楚。研究表明,镉的致癌机制十分复杂,不仅涉及到遗传机制,还涉及到表观遗传机制。然而lncRNA在镉致癌的过程中起到什么角色的作用目前还不知道。
　　Long non-coding RNA(LncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子。随着lncRNA不断被发现,LncRNA不再被认为是基因组转录的“噪音”,lncRNA在各种生物学过程、疾病以及许多癌细胞中表达水平会发生明显改变。这提示有些lncRNA很可能作为肿瘤特异性标志物,随着对其功能的研究,为寻找治疗肿瘤的新方法提供了一种新的思路。
　　然而lncRNA的研究还仅仅只是处于起步阶段,其功能与调控机制尚不明确。近年来,对miRNA的研究取得了很大的成果,特别是miRNA在金属毒物的毒作用中作为生物标志物的探索得到了初步的证实。然而,目前对lncRNA研究比较少,对lncRNA及其功能的研究仅仅是冰山一角,对lncRNA在环境毒物中的研究更是鲜有报道。随着科学家对lncRNA的深入研究,将有更多的lncRNA被发现并证实与更多的疾病有关系。但目前对lncRNA通过什么机制影响疾病,其具体功能和调控机制是如何善不清楚。
　　2.目的:
　　2.1、探索镉恶性转化16HBE细胞中lncRNA和信使RNA(Message RNA,mRNA)的差异表达谱。
　　2.2、筛选出差异显著的lncRNA及其基因座附近协同变化的基因,从而探索lncRNA在镉致癌作用过程中的潜在作用。
　　2.3、探索镉恶性转化16HBE细胞中lncRNA对DNA修复基因的调控作用。
　　3.方法:
　　3.1、mRNA与lncRNA芯片检测
　　提取细胞总RNA,进行RNA质量检测、cDNA样本合成和标记、使用Nanodrop检测荧光标记效率、在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。使用相关的芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果换成数字型数据保存,使用配套软件对原始数据进行分析运算。对芯片产生的数据进行处理和均一化后,利用统计方法筛选出差异表达的LncRNA,以参数选择P<0.05,fold change≥2,为筛选有差异表达。
　　3.2、生物信息学分析
　　①差异LncRNA重注释(对差异LncRNA在基因组上进行重定位,确定其在染色体上的位置和其他基因的关系)、
　　②差异LncRNA靶基因预测(包括cis靶基因预测、trans靶基因预测和LncRNA在蛋白水平的靶基因预测)、
　　③靶基因gene ontology分析(将靶基因向gene ontology数据库各节点映射,计算每个节点的基因数目)、
　　④靶基因pathway分析(向KEGG pathway数据库映射,并统计基因在每个pathway中的富集程度)、
　　⑤绘制LncRNA与靶基因调控网络图、
　　⑥转录因子结合位点预测(对于差异表达LncRNA,提取转录位点上游2500bp、下游500bp的序列。使用paster等预测程序对其转录因子结合位点进行预测、
　　⑦差异LncRNA与mRNA芯片关联分析,根据调节方向进一步筛选靶基因和分析LncRNA的功能。
　　3.3、荧光定量PCR检测
　　从差异表达LncRNA谱中选择差异最明显的20种高表达LncRNA为验证对象。选取正常16HBE细胞,镉处理16HBE细胞5代龄(未恶性转化),镉处理16HBE细胞15代龄(未恶性转化)、镉处理16HBE细胞35代龄(已恶性转化)和恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞作为镉诱导细胞恶型转化不同阶段的实验细胞。采用RT-PCR检测以上20种LncRNA在以上细胞系中的表达情况,分析其表达规律。
　　3.4、RNA干扰技术
　　在20个已验证的高表达lncRNA中选取两个在正常16HBE细胞,镉处理16HBE细胞5代龄,镉处理16HBE细胞15代龄、镉处理16HBE细胞35代龄和恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞中表达规律最明显的LncRNA(ENST00000414355、ENST00000446135),设计符合条件的siRNA序列,构建目标LncRNA表达沉默序列(三组)和对照序列,对正常16HBE细胞和镉处理16HBE细胞35代龄和恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞进行基因转染。实验分3组:目的质粒转染组、对照siRNA干扰转染组和未转染组。转染48h-72h后收集每组细胞。用RT-PCR检测目标LncRNA的表达水平验证LncRNA沉默的效果。
　　3.5、RNA干扰后相关DNA修复基因检测
　　将两个siRNA-LncRNA表达沉默效果最好最中的正常16HBE细胞和恶性转化成瘤细胞,采用QPCR检测20种DNA修复相关基因在细胞中的表达情况,分析其表达规律。
　　4.结果:
　　4.1、lncRNA芯片检测结果
　　利用统计方法筛选出差异表达的LncRNA,以参数选择P<0.05,fold change≥2,筛选出差异高表达的lncRNA有374个,其中差异高表达折叠倍数最高的是20.39倍,差异高表达折叠倍数最低的是2.00倍,差异倍数≥4的有49个占高表达lncRNA的13.10％;差异低表达的lncRNA有95个,其中差异低表达倍数最高的是18.19倍,差异低表达倍数最低的是2.00倍,差异倍数≥4的有8个占低表达lncRNA的8.42%。
　　4.2、mRNA芯片检测结果
　　利用统计方法筛选出差异表达的LncRNA,以参数选择P<0.05,fold change≥2,筛选出差异高表达的mRNA有366个,其中差异高表达折叠倍数最高的是10.76倍,差异高表达折叠倍数最低的是2.00倍,差异倍数≥4的有33个占高表达lncRNA的9.02%;差异低表达的lncRNA有132个,其中差异低表达倍数最高的是78.20倍,差异低表达倍数最低的是2.00倍,差异倍数≥4的有23个占低表达lncRNA的17.42%。
　　4.3、生物信息学分析结果
　　同过GO功能分类注释得出,差异表达的mRNA在细胞组成方面,在细胞器、细胞核、细胞质、膜胞器等方面都起到功能;在分子功能方面,参与分子粘合物、蛋白结合物、核苷酸结合物、激酶活性和转移酶活性等功能;在生物学过程中,参与新陈代谢过程、初级代谢过程、细胞代谢过程、细胞周期过程、生物学周期过程等过程。通过Pathway分析差异表达的mRNA在细胞周期、前列腺癌、P53信号通路、甲状腺癌、子宫内膜癌、Wnt信号通路、神经胶质瘤、膀胱癌、轴突导向、胰腺癌等方面功能的基因有显著地变化。
　　4.4、筛选出来的lncRNA荧光定量PCR检测结果
　　20个高表达lncRNA在正常16HBE细胞,镉处理16HBE细胞5代龄(未成瘤),镉处理16HBE细胞15代龄(未成瘤)、镉处理16HBE细胞35代龄(恶性转化已成瘤)和恶性转化细胞接种裸鼠成瘤细胞作为镉诱导细胞恶型转化不同阶段的实验组细胞中大部分lncRNA的表达结果与芯片实验结果一致都呈现表达上调。其中ENST00000414355、ENST00000446135两个lncRNA在正常16HBE细胞、氯化镉转化16HBE第5代细胞、氯化镉转化16HBE第15代细胞、氯化镉转化16HBE第35代细胞中表达趋势最明显呈上升趋势,但在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中的表达量反而下降
　　4.5、RNA干扰效果
　　ENST00000414355干扰48h后,正常16HBE细胞和氯化镉转化16HBE成瘤细胞中ENST00000414355的表达量下降,达到干扰沉寂效果,氯化镉转化16HBE第35代细胞在ENST00000414355三条阳性序列转染下没有出现干扰效果,其中正常16HBE细胞在第三条阳性序列转染下干扰效果最好,而氯化镉转化16HBE成瘤细胞中第一条阳性序列转染下干扰效果最好;ENST00000446135干扰72h后,正常16HBE细胞和氯化镉转化16HBE成瘤细胞ENST00000446135的表达量下降,达到干扰沉寂效果,氯化镉转化16HBE第35代细胞在ENST00000446135三条阳性序列转染下没有出现干扰效果,其中正常16HBE细胞和氯化镉转化16HBE成瘤细胞都是在第一条阳性序列转染下干扰效果最好。
　　4.6、lncRNA干扰后DNA修复基因的表达改变情况
　　LncRNA(ENST00000414355、ENST00000446135)沉默之后,20个DNA修复基因在正常16HBE细胞和氯化镉转化16HBE成瘤细胞中的表达都有变化,其中LncRNA ENST00000414355沉默后DDB1、DDB2表达水平变化在16HBE细胞(0.58)中最明显,均呈高表达;OGG1在氯化镉转化16HBE成瘤细胞中表达水平变化最明显,呈高表达。
　　5.结论:
　　5.1.镉恶性转化16HBE细胞中存在lncRNA和mRNA差异表达谱,部分lncRNA随着镉恶性转化16HBE细胞代数的增加其表达逐渐上调。
　　5.2.通过RNA干扰技术,发现LncRNA(ENST00000414355、ENST00000446135)在镉恶性转化16HBE细胞中调控了DNA修复多个途径的基因的表达。
　　5.3.LncRNA可能是镉恶性转化16HBE细胞新的分子机制之一,而LncRNA(ENST00000414355、ENST00000446135)可以作为镉致癌早期诊断的分子标记物的参考指标,也适合高危人群的筛检。

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中文摘要

英文摘要

英文缩略词汇表

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1基因芯片筛选差异表达的lncRNA中总RNA定量及质量检测

2.2 NanoDrop ND-1000检测荧光标记的cRNA质量

2.3 芯片杂交实验结果

2.4 生物学途径分析及基因本体论分析（生物信息学分析）

2.5 QPCR验证实验结果

2.6 siRNA干扰的实验结果

2.7 siRNA干扰后20个凋亡、修复相关基因的表达变化

2.8 DDB1、DDB2和OGG1受LncRNA 调控改变的信息学分析结果

3 讨 论

结 论

参考文献

综述

附录

在校期间发表的论文

致谢

参考文献