对家蚕几丁质酶具强水解活性的弹性蛋白酶Chi-Elastase的分离及其相关分子基础研究

摘要

本研究以家蚕几丁质酶作为靶标，旨在自然环境中筛选分离几丁质酶抑制化合物产生菌；对筛选出的目的菌株进行菌种鉴定、培养条件的优化；在分离纯化活性物质的基础上，进行活性物质编码相关基因的克隆分析和抑制机理的探讨。 1.几丁质酶抑制物产生菌的筛选。 首先建立了几丁质酶抑制物简易检测方法——平板透明圈法，此法便于在初筛过程中进行高通量筛选。以此方法从采自全国的200多份土样中分离出的1350多株菌中筛选出五株几丁质酶抑制物产生菌；复筛时使用铁氰化钾方法和3，5-二硝基水杨酸法确定了能稳定生成几丁质酶抑制物的1237＃菌株。 1237＃菌株活性发酵液对几种酶的抑制谱分析结果显示1237＃菌株活性发酵液对链霉菌几丁质酶、沙雷氏菌几丁质酶、假单胞菌几丁质酶及植酸酶、纤维素酶、a-淀粉酶无抑制效果，仅仅对家蚕几丁质酶具有强烈地抑制活性。 2.几丁质酶抑制物产生菌的菌种鉴定。 系统地进行了1237＃菌株的分类鉴定。研究结果表明，1237＃菌株为革兰氏阴性杆状细菌，菌体大小为0.5-0.8um×1.5-2um；是无芽孢，具鞭毛，能运动的好氧菌；37℃在马铃薯固体培养基上生长18-24h菌体呈绿色；过氧化氢酶和氧化酶反应均呈阳性；明胶水解反应为阳性；脓青素反应为阴性。最适生长温度为37℃，4℃不生长，41℃能生长。以1237＃菌株基因组为模板，用细菌16SrRNA基因通用引物扩增了1237＃菌株16SrRNA基因，扩增片段与pMD-18T载体连接后，转化入大肠杆菌E.coliDH5a感受态细胞，筛选阳性重组质粒进行测序分析。测得片段大小为1606bp，与NCBI核酸库进行比对分析的结果表明其与多种假单胞菌16SrRNA基因(GenBank登录号：AF125317、AB117953、AJ249451)同源性在99﹪以上。 综合形态学特征、生理生化特性及16SrRNA基因测序分析结果，鉴定几丁质酶抑制物产生菌1237＃菌株为假单胞菌，命名为Pseudomonassp.1237＃。 3.几丁质酶抑制活性成分的分离纯化及性质研究。 为建立合理的纯化方法体系，首先探索了Pseudomonas.sp1237＃菌株代谢产物中几丁质酶抑制物的理化性质。研究结果表明该几丁质酶抑制物不能耐受较高温度，60℃处理30分钟，活性丧失殆尽；不溶于有机溶剂，乙酸乙酯不能将其萃取提出，氯仿对几丁质酶抑制物活性具有很大的破坏作用；盐析、有机溶剂沉淀等方法能将活性物质沉淀析出。初步研究结果表明该几丁质酶抑制物为蛋白类物质。 在对Pseudomonas.sp1237＃菌株几丁质酶抑制物理化性质有了初步了解的前提下，本研究借鉴蛋白质纯化的经典策略，设计了活性物质的纯化方法体系，整个纯化过程中始终追踪其对家蚕几丁质酶的抑制活性。通过丙酮沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow开放柱、Superdex75低压液相色谱纯化活性物质，纯化得到的活性物质经HPLC检测为单峰、SDS-PAGE检测为单带。 SDS-PAGE测定该几丁质酶抑制物的分子量在34KDa左右，测定其N-端10个氨基酸序列为AEAGGPGGNQ。与NCBI核酸库的比对结果表明，该活性物质N-端10个氨基酸序列与假单胞菌弹性蛋白酶成熟蛋白(GenBank登录号：AAZ81561)的前10个氨基酸序列同源性为100﹪。弹性蛋白酶检测结果表明，该几丁质酶抑制物具有弹性蛋白酶活性。据此，本研究将Pseudomonas.sp1237＃菌株几丁质酶抑制活性成分命名为Chi-Elastase。 比较分析了Chi-Elastase及几丁质酶抑制剂Allosamidin与家蚕几丁质酶相互作用以后SDS-PAGE电泳条带的不同，电泳结果表明Chi-Elastase以一种不同于Allosamidin的方式对家蚕几丁质酶活性产生影响，Chi-Elastase通过降解家蚕几丁质酶而导致其丧失活性：Chi-Elastase与3种不同来源的几丁质酶相互作用后的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳结果表明，Chi-Elastase只能降解家蚕几丁质酶，而对其它2种几丁质酶不产生任何影响； 用纯品注射四龄第一天家蚕的研究结果表明，Chi-Elastase能够对家蚕代谢产生影响，并在较高处理剂量时导致家蚕死亡。 4.Chi-Elastase生产条件的优化。 研究结果表明以下条件是Pseudomonassp.1237＃菌株生成Chi-Elastase的理想条件：培养温度37℃，牛肉膏、蛋白胨为氮源，葡萄糖为碳源，初始pH值为8.0，30﹪的装瓶量。另外，[Fe]3+、[Mn]2+、[Ca]2+等金属离子对Pseudomonas.sp1237＃菌株生成几丁质酶抑制物具有极大的促进作用。 5.Chi-Elastase编码基因的克隆分析及表达研究。 以Pseudomonassp.1237＃基因组DNA为模板，通过对Chi-ElastaseN端序列的比较分析，设计引物扩增Chi-Elastase前体蛋白编码基因。上游引物为：5，-GAGGAATTCATGAAGAAGGTTTCTACGCTT-3’；下游引物为5’-GAGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAGGT-3’；扩增片段的测序分析结果表明该基因长度为1525bp，其与假单胞菌PA01弹性蛋白酶编码基因的同源性在99﹪以上。扩增基因的ORF分析结果表明Chi-Elastase前体蛋白全长498个氨基酸，其中N+端前197个氨基酸为信号肽或前导肽氨基酸序列，在蛋白质折叠加工过程中被剪切。成熟蛋白质由301个氨基酸组成，N端前十个氨基酸序列为AEAGGPGGNQ，与经转膜测序的N端10个氨基酸序列完全一致。ORF分析结果表明，该基因编码的氨基酸序列与假单胞菌PA01弹性蛋白酶氨基酸序列仅四个氨基酸存在差异。 设计表达引物扩增Chi-Elastase成熟蛋白编码序列，并将其与pET-28a(+)载体连接构建原核表达载体Chi-Elastase/pET28a。将表达载体转入感受态细胞E.coliDH5a，筛选阳性表达质粒转入原核表达细菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导后，检测表达产物具几丁质酶抑制活性。 6.Chi-Elastase特异性水解家蚕几丁质酶机理的初探。 Chi-Elastase抑制酶活性谱的研究表明，它能强烈地影响家蚕几丁质酶的活性，而对假单胞菌几丁质酶、链霉菌几丁质酶、沙雷氏菌几丁质酶及植酸酶、纤维素酶、a-淀粉酶的活性几乎不产生任何影响。鉴于Chi-Elastase对于不同来源几丁质酶作用效果呈现明显差异，本研究主要通过比较分析4种不同来源几丁质酶一级结构、二级结构和三级结构的差异，推测产生这种特异性抑制作用可能存在的原因。一级结构分析结果表明家蚕几丁质酶与假单胞菌几丁质酶氨基酸序列差异非常大，和沙雷氏菌、链霉菌氨基酸序列也有较大差距(尤其是活性位点的氨基酸组成)；二级结构分析表明家蚕几丁质酶活性位点氨基酸全部处于松散结构，而其它几种几丁质酶活性位点氨基酸多数处于螺旋或者折叠结构；几丁质酶功能结构域分析结果表明4种几丁质酶均具有糖基水解酶活性结构域，它们结构上的差异主要在于家蚕几丁质酶具有CHtBD2型几丁质结合结构域，而其余几种几丁质酶不具有该结构域；3D结构分析结果表明4种几丁质酶都具有活性区域的TIM桶状结构，但家蚕几丁质酶空间结构较为松散，活性位点氨基酸更加暴露。家蚕几丁质酶所具有的上述结构特征，使其形成的空间构象适宜与Chi-Elastase发生相互作用，导致家蚕几丁质酶丧失活性。 家蚕是鳞翅目昆虫的模式生物，而自然界的农林害虫中，半数以上属鳞翅目昆虫，开发具有新作用机制的无公害农药是十分紧迫的现实要求，本研究的结果具有相应的理论意义和实践意义。

目录

文摘

英文文摘

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第1章文献综述

第2章引言

第3章几丁质酶抑制物产生菌的分离筛选

第4章几丁质酶抑制物产生菌的菌种鉴定

第5章几丁质酶抑制活性成分的分离纯化及性质研究

第6章Chi-Elastase生产条件的优化

第7章Chi-Elastase编码基因的克隆分析及表达研究

第8章Chi-Elastase特异性水解家蚕几丁质酶机理的初探

第9章主要研究结论

参考文献

攻读博士学位期间发表论文及参研课题情况

致 谢