几丁质酶抑制活性蛋白酶基因和类胡萝卜素结合蛋白基因转家蚕表达研究

摘要

随着化学农药的大量使用，对环境造成了严重的危害，迫切需要采用生物防治手段来替代。自然界中的农业害虫半数以上属鳞翅目昆虫，而家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，以其为实验材料进行生物防治的研究无疑有着重要的意义。基于此，本实验室谢洁博士以家蚕几丁质酶作为靶标，在土壤微生物中筛选得到几丁质酶抑制物产生菌Pseudomonas sp.1237＃菌株，该菌株发酵液对家蚕几丁质酶具有强烈的抑制作用。经鉴定该几丁质酶抑制物为一种弹性蛋白酶，命名为Chi-Elastase。通过对Chi-Elastase N-端序列的比较分析，设计引物克隆了该蛋白酶编码基因。在此实验基础上，为了进一步验证Chi-Elastase在生物防治上应用的可行性，本文采用家蚕GAL4/UAS系统对编码该蛋白酶的成熟肽基因Chi-mELastase进行了转基因研究。 另外，本文还对类胡萝卜素结合蛋白基因(CBP)进行了转基因研究。蚕茧的颜色受到相关基因的严格控制，黄、红茧品系茧色以y基因的存在为前提。免疫学分析表明，CBP蛋白只在携带Y基因的家蚕品系中存在，据此推测Y基因可能控制CBP的表达。为了进一步探明CBP基因与Y基因的关系，本研究建立了CBP家蚕转基因系，对CBP基因进行功能分析。 获得的主要结果如下： 1 UAS-Chi-mElastase转基因家蚕品系的建立 本研究利用来源于Pseudomonas sp.1237＃菌株的弹性蛋白酶成熟肽基因Chi-mElastase，构建了转基因载体pBac[3xp3-DsRed+UAS-Chi-mElastase]，通过显微注射蚕卵，获得105个G1蛾区。经过对中后期胚胎的荧光检测，筛选到1个转基因阳性蛾区。经Southem blot分析表明，转基因表达盒已经整合到家蚕染色体上，即UAS-Chi-mElastase转基因家蚕品系构建成功。 2 Chi-mElastase基因表达检测 将获得的UAS-Chi-mElastase转基因系与A3GAL4转基因系杂交，挑选出同时表达红色荧光和绿色荧光的转基因蚕进行Chi-mElastase转基因表达分析。以中肠和表皮cDNA为模板进行RT-PCR分析，结果显示靶基因Chi-mElastase在这两个组织中已经被激活转录。 3 Chi-mElastase抗体制备及转基因蚕蛋白质分析 将Chi-mElastase基因编码区序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体，构建重组表达质粒，并将该重组质粒转化BL21菌株。通过IPTG诱导重组菌pET-28a-Chi-mElastase表达蛋白，得到一个约36kD的重组蛋白(其中标签蛋白约6kD，目的蛋白约30kD)，与预测分子量大小相符合。表达条件的优化，发现最佳的诱导条件为37℃、0.6mM/L IPTG诱导6h。 通过亲和层析，切胶及电洗脱纯化原核表达的Chi-mElastase蛋白，免疫小鼠制备抗体。Western blot分析Chi-mElastase蛋白在中肠、表皮和蛹中的表达情况，结果显示中肠、表皮中没有检测到杂交信号，而蛹中有杂交信号的存在。平板透明圈法没有检测到该蛋白酶的抑制活性。 4 Chi-mElastase基因对于家蚕生长发育影响的调查 对UAS-Chi-mElatase转基因系与A3GAL4转基因系杂交后代生长发育情况进行调查。杂交后代根据荧光表达情况分四种情况：既发红色荧光又发绿色荧光，单发红色荧光，单发绿色荧光和不发荧光。各挑取150头，在25℃，相对湿度75％的智能人工气候箱里以人工饲料饲养。观察既发红光又发绿光的转基因蚕生长发育情况，另外三种情况作为对照。结果表明转UAS-Chi-mElatase基因蚕完成了整个生活史，没有出现异常现象，与对照完全一致。 基于所述，本研究获得了Chi-mElastase转基因家蚕，RT-PCR结果显示Chi-mElastase基因已经被GAL4激活转录，Western blot分析表明Chi-mElastase基因正确表达。但没有检测到Chi-mElastase蛋白的几丁质酶抑制活性，也没有观察到该基因对家蚕生长发育的影响，转基因家蚕完成了整个生活周期，与对照相比，并无明显差异。本研究结果显示，Chi-Elastase在生物防治上应用的渠道甚至可行性，尚需进一步探讨。 5 CBP基因转家蚕表达研究的实验结果 本研究将CBP基因分别与BmStart1基因上有调控序列(pBmStart1)、CBP基因上游调控序列(pCBP)及IE1启动子构建成3个转基因表达载体。注射蚕卵后，分别获得139个、31个和51个G1蛾区。经过对中后期胚胎的荧光检测，分别获得5个、1个和1个转基因阳性蛾区。经过Southern blot及RT-PCR分析表明，3个转基因表达盒都已经整合到家蚕染色体上，并都进行了转录，CBP基因的表达量在IE1CBP转基因系中最高，在pcBPCBP转基因系中次之，在pBmStart1CBP转基因系中最低。我们观察了CBP转基因家蚕的黄血黄茧性状恢复情况，发现除了pBmStart1CBP转基因系外，另外两个转基因系都恢复了部分黄血黄茧性状，恢复程度与RT-PCR结果一致。这些研究结果表明，类胡罗卜素结合蛋白(CBP)是Y基因的产物。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1几丁质的概述

1.2几丁质酶的研究进展

1.2.1几丁质酶分布及种类

1.2.2几丁质酶的生化特性

1.2.3几丁质酶在昆虫蜕皮中的生理作用

1.3几丁质酶抑制物的研究进展

1.3.1几丁质酶抑制物国内外研究概况

1.3.2几丁质酶抑制物的种类

1.3.3几丁质酶抑制物的作用机理

1.3.4几丁质酶抑制物的应用前景

1.4 GAL4/UAS系统在转基因研究中的应用

1.4.1 GAL4/UAS系统的原理

1.4.2 GAL4/UAS的优势

第二章引言

2.1研究目的及意义

2.2研究内容

2.3技术路线

第三UAS-Chi-mElastase转基因家蚕品系的建立

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.3.1 UAS-Chi-mElastase转基因载体的构建

3.3.2转基因蚕的制作及荧光检测

3.3.3转基因蚕Southern blot分析

3.4讨论

第四Chi-mElastase抗体制备及转基因家蚕分析

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.3.1重组表达质粒的构建

4.3.2 pET-28a-Chi-mElastase的诱导表达

4.3.3蛋白表达条件的优化

4.3.4包涵体的提取与纯化

4.3.5抗体的制备及获取

4.3.6转基因蚕分子检测

4.3.7蛋白质活性检测

4.3.8转基因蚕生长发育情况调查

4.4讨论

第五章 类胡萝卜素结合蛋白基因(CBP)转家蚕表达研究

5.1实验材料

5.2实验方法

5.3结果与分析

5.3.1转CBP基因载体的构建

5.3.2转CBP基因蚕的制作及荧光检测

5.3.3转CBP基因蚕的分子检测

5.3.4转CBP基因蚕表型观察

5.4讨论

第六章结论

参考文献

发表论文目录及参与课题一览表

附录：英文缩写一览表

致谢