油菜BnAGL15、矮牵牛PMADS9基因的克隆、表达载体构建及其BnAGL15对矮牵牛的转化

摘要

MADS-box基因是指含有保守的DNA结合域MADS盒的转录调控因子，它们广泛存在丁真核生物界。MADS是由儿个最初发现的成员——酵母MCMI、拟南芥AGAMOUS、金鱼草DIFICIENS和人类SRF——的首字母组合而来。MADS-box基因是一类重要调节基因，在植物发育(尤其是花器官发育以及同源异型转换中)过程中扮演着十分重要的角色。分离并研究MADS-box基因，将有助于探明植物生殖发育的分子模式，并为观赏植物和花卉品种的基因工程改良奠定基础。 AGL15是MADS-box基冈家族成员，研究显示具有延缓植物花朵衰老的功效，作用途径可能独立于乙烯介导的调控衰老途径。PMADS9是最近在观赏花卉矮牵牛中发现的AGL15亚家族基因，其功能尚未报道。本实验通过PCR技术从油菜基因组DNA中克隆出BnAGL15基因、从矮牵牛幼蕾cDNA中克隆出PMADS9基因，分别构建了植物表达载体，并利用农杆菌介导法将BnAGL15基因导入矮牵牛。主要实验结果如下： 1．油菜BnAGL15基因的克隆与表达载体构建以油菜(Brassica napus)基因组DNA为模板，通过设计一对特异引物，利用PCR技术扩增获得BnAGL15基因(GenBank登录号：DQ418546)。序列分析表明，该基因长1695bp，含7个内含子，编码264个氨基酸。与已报道的序列(GenBank登录号：BNU22665)相比较，核苷酸序列及推导的氨基酸序列相似性分别为98.47％和99.25％。构建了正义植物表达载体pBIN-BnAGL15。 2．矮牵牛PMADS9基因的克隆与表达载体构建以矮牵牛(Petunia hybrida)幼蕾cDNA为模板，通过设计一对特异引物，利用PCR技术扩增获得PMADS9基因(GenBank登录号：DQ418547)。序列分析表明，该基因长811bp，含-810bp的开放阅读框，编码269个氨基酸。与网上已公布序列(GenBank登录号：AY370526)比对，核苷酸相似性达99.75％，推测氨基酸序列相似性达99.26％。构建了正义植物表达载体pBL-PMADS9 (+)和反义植物表达载体pBIN-PMADS9(-)。 3．BnAGL15基因对矮牵牛的遗传转化利用农杆菌介导法将pBIN-BnAGL15导入矮牵牛中，共获得6个独立的矮牵牛抗性株系，其中4个株系移栽成活并开花。PCR检测初步确定BnAGL15基因已转入矮牵牛基因组中。

目录

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摘 要

第1章文献综述

1.1植物MADS-box基因研究进展

1.1.1 MADS-box基因的概述

1.1.2植物MADS-box基因及其编码的蛋白转录因子的结构

1.1.3植物MADS-box基因的调节机理

1.1.4植物MADS-box基因与花器官的发育

1.1.5植物MADS-box基因的生物学功能及其多效性

1.2 AGL15亚家族基因研究进展

1.3花朵延衰及切花保鲜研究进展

第2章引 言

第3章油菜BnAGL15基因的克隆及表达载体构建

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌种和质粒

3.1.3主要试剂

3.1.4主要设备

3.1.5常用溶液配方

3.2实验方法

3.2.1油菜BnAGL15基因的克隆

3.2.2植物表达载体pBIN-BnAGL15的构建

3.3结果与分析

3.3.1油菜BnAGL15基因的克隆与序列分析

3.3.2植物表达载体pBIN-BnAGL15的构建

第4章矮牵牛PMADS9基因的克隆及表达载体构建

4.1实验材料

4.1.1植物材料

4.1.2菌种和质粒

4.1.3主要试剂

4.1.4主要设备

4.1.5常用溶液配方

4.2实验方法

4.2.1矮牵牛PMADS9基因的克隆

4.2.2植物表达载体构建

4.3结果与分析

4.3.1矮牵牛PMADS9基因的克隆与序列分析

4.3.2植物表达载体pBIN-PMADS9(-)的构建

4.3.3植物表达载体pBL-PMADS9(+)的构建

第5章油菜BnAGL15基因对矮牵牛的遗传转化

5.1实验材料

5.1.1植物材料

5.1.2菌种和质粒

5.1.3主要试剂

5.1.4主要设备

5.1.5基本培养基配方

5.2实验方法

5.2.1培养条件

5.2.2矮牵牛的遗传转化

5.2.3转基因植株的检测

5.3结果与分析

5.3.1矮牵牛的遗传转化

5.3.2 PCR检测

第6章讨 论

6.1油菜BnAGL15及矮牵牛PMADS9基因的克隆

6.2扩增获得BnAGL15及PMADS9基因的特点

6.3表达载体构建

6.4矮牵牛的遗传转化

6.5转基因植株的鉴定

6.6后续研究

第7章结 论

参考文献

缩略词表

致 谢

附 录