甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系中d染色体导入甘蓝的初步研究

摘要

甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系(Rape-radish with d-chromosome addition line，AACC+dd，2n=40)是通过甘蓝型油菜(Brassica nupus，AACC，2n=38)与萝卜(Raphanus sativus，RR，2n=18)的杂交，经杂种染色体加倍与母本多次回交获得的具萝卜d染色体的新型油菜材料。Peterka研究发现萝卜9条染色体中——d染色体具有抗线虫效应，而芸薹属(Brassica．CC，2n=18)植物则容易受线虫病侵染。本试验目的希望通过甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系与甘蓝的有性杂交，能够获得具有萝卜d染色体的杂种后代，为选育具线虫抗性的新型甘蓝品种提供相关品种材料。 甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系与甘蓝的杂交存在远缘杂交障碍，本试验选取染色体数目较多的附加系为母本、甘蓝为父本进行有性杂交，并通过人工干涉来促进亲和性提高。电镜观察父本花粉在附加系柱头上的萌发情况，异源花粉刺激柱头乳突细胞产生大量胼胝质以抵制花粉管的侵入，部分花粉管受阻，但仍有部分进入柱头并与胚珠结合。 花粉管能与雌配子结合是有性杂交成功的先决条件。在田间去雄授粉试验中，以甘氨酸(G1y 100mg/L)、赤霉素(GA3 60mg/L)、重复授粉及无特殊处理对照(CK)对柱头进行处理，发现：三种特殊处理方式对促进杂交亲和性都有一定作用。其中GA3 60mg/L能有效提高结籽率，重复授粉对促进结角效果最好。胚胎挽救可为胚的形成提供必要的养分和激素。本试验以不同发育天数的受精子房为培养对象，在不同培养基上进行子房培养，共获得26粒种子，并对不同子房天数和培养基效果进行比较：(1)普遍以10天左右的受精子房进行子房培养可获得高结籽率。(2)子房在“White(1963)+VB6(0.5mg/L)+VB1(0.5mg/L)+甘氨酸(15mg/L)+烟酸(2.5mg/L)+IAA(1.5 mg/L)+蔗糖(50g/L)，pH=5.6”和“1/2MS+B5维生素+IAA(1.5mg/L)+蔗糖(50g/L)，pH=5.8”这两种培养基上均能获得较高的结籽率，分别为3.37和4.26。 田间与离体培养获得的再生植株在形态学上偏向母本，个别形态标记如叶片形状等处于父母本中间型，极少数植株出现不同于父母本的浅紫色茎杆。利用已知萝卜d染色体的特异分子标记引物OPE07-363与OPE03-518对子代与父母本DNA进行RAPD实验，筛选出在363bp与518bp处有与母本d染色体特异带型相同的子代植株4株，并通过SSR标记与根尖细胞染色体计数来鉴定杂种真实性。经鉴定，子代植株DNA模板经与引物结合、PCR扩增电泳后于167bp与248bp处显示出不同于父母本的差异带型；对4株再生苗中存活的3株进行细胞学鉴定，显微镜下观察到根尖染色体数目分别是：29、29、48(或49)。即3株再生苗：2株三倍体(ACC+d，3x=29)，和1株五倍体(AACCC+dd，5x=49)或(AACCC+d，5x=48)。从而确定这三株植株确为附加系dox甘蓝的真杂种。 花粉活力高低是决定植株育性的重要因素之一。醋酸洋红可与脱氢辅酶结合显红色，不具活力的花粉由于缺失脱氢辅酶从而不能染色。本试验将染色后的子代花粉与父母本相比较，子代花粉具有一定育性，但育性低，仅为11.32％；但有活力的子代花粉体大饱满，染色情况较父母本深，形态处于母父本花粉形态中间型。

目录

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第一章文献综述

1.引言

2.远缘杂交的目的和意义

2.1创造新的作物类型

2.2异染色体系的创建和培育优良品种

2.3诱导单倍体

2.4杂种优势的利用

2.5丰富植物的变异类型

2.6系统发育和进化、亲缘关系的研究

3.远缘杂交生殖隔离机理的研究

3.1远缘杂交受精障碍

3.2假受精与半配合

3.3受精后的胚胎发育障碍

3.4杂种夭亡或不育现象

4.远缘杂交不亲和的克服方法

4.1远缘杂交生殖隔离的克服方法

4.2克服杂种夭亡和不育的方法

5.远缘杂种的鉴定

5.1形态学鉴定

5.2细胞学鉴定

5.3原位杂交技术

5.4同工酶鉴定

5.5分子标记

5.6杂种花粉活性测定

第二章甘蓝花粉在甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系柱头上萌发的电镜观察

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2结果分析

3小结与讨论

第三章甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系与甘蓝杂交亲和性的初步研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2结果分析

2.1田间特殊授粉对亲和性的影响

2.2子房培养对杂交亲和性的影响

3小结与讨论

第四章甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系与甘蓝杂交F1杂种筛选与鉴定

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果分析

2.1 RAPD标记对含有萝卜d染色体杂种的筛选

2.2形态学鉴定

2.3细胞学观察

2.4 SSR标记对杂种的鉴定

2.5杂种F1花粉活力测定

3小结与讨论

第五章结论

参考文献

致谢

附录